[发明专利]一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法

摘要

本发明提供一种利用PMI(phosphomannose isomerase，磷酸甘露糖异构酶)筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法。具体而言，本发明通过含有pCAMBIA1381‑PMI载体的农杆菌菌株EHA105介导，以甘露糖为筛选剂，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30中。通过PCR检测鉴定，表明外源基因已导入8m30中。该方法成功实现了闭颖授粉的粳稻品种的遗传转化，且无需使用抗生素或除草剂筛选，在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，提高了环境友好程度。

主权项

一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：步骤1：分离出水稻种子的胚，并置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；步骤2：将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；步骤3：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI(phosphomannose isomerase)筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；步骤4：将步骤3处理后的愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；步骤5将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；步骤6将步骤5处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根，所述步骤4中采用垫有若干无菌滤纸的培养皿，所述无菌滤纸中加入2.5‑3.5mL农杆菌悬浮培养基，选择23℃黑暗培养；其中，所述诱导培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L 2,4‑D、3g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3‑]/[NH4+]＝40mM/10mM；所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中；所述农杆菌悬浮培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、 MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2，4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮，该预定配比的N6大量元素中[NO3‑]/[NH4+]＝40mM/10mM；所述前筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L 2,4‑D、3g/L植物凝胶、250mg/L羧苄青霉素，该预定配比的N6大量元素中[NO3‑]/[NH4+]＝40mM/10mM；所述筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、5g/L蔗糖、10g/L甘露糖、2mg/L 2,4‑D、250mg/L羧苄青霉素、3g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3‑]/[NH4+]＝40mM/10mM；所述分化再生培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L 2‑(N‑吗啉)乙磺酸(MES)、2.5mg/L CuSO4、1.5mg/L NAA、1mg/L 6‑BA、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3‑]/[NH4+]＝40mM/10mM；所述生根培养基包括1/2MS(Murashige&Skoog)基础盐2.l65g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、0.4mg/L NAA、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。