[发明专利]一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法

摘要

本发明的目的是提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，本发明中引物设计充分考虑到在构建质粒FA、FB和FC时要保证各段基因开放阅读框的完整性，尤其是质粒FB含有完整H基因和F基因，H和F基因是CDV主演的研究内容，对毒力和免疫原性有重要影响，质粒FB的构建为本发明在以后使用中对CDV主要研究内容的基因操作提供了便利，此外个各引物和酶切位点的选择也是基于这方面的考虑，可以将各主要基因片段完整酶切替换等基因克隆操作。总之，本方法中通过间质粒FA、FB和FC的构建相比有方法大量减少了基因克隆的次数，位后期不同目的用途提供了便利条件。

主权项

一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：引物名称引物序列序列表顺序F1f5’‑ACCAGACAAAGTTGGCTAT‑3’SEQ ID NO:1F1r5’‑AGTAAGCATCCTCATCTTGG‑3’SEQ ID NO:2F2f5’‑ATGAGGATGCTTACTAAGATGC‑3’SEQ ID NO:3F2r5’‑TGGATCTATTACTCTGACTTGG‑3’SEQ ID NO:4F3f5’‑AGAGTAATAGATCCAGGACTCG‑3’SEQ ID NO:5F3r5’‑AGGCACCACAGGACTAAC‑3’SEQ ID NO:6F4f5’‑CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT‑3’SEQ ID NO:7F4r5’‑ATCATATCACCTCCAGAGTATC‑3’SEQ ID NO:8F5f5’‑AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT‑3’SEQ ID NO:9F5r5’‑GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT‑3’SEQ ID NO:10F6f5’‑ATGCTGACCGCTACCTCAGAC‑3’SEQ ID NO:11F6r5’‑GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC‑3’SEQ ID NO:12F7f5’‑TAACATCGCCAACTCTACAACCA‑3’SEQ ID NO:13F7R5’‑CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA‑3’SEQ ID NO:14F8f5’‑TGATACTGCTATGGCAATTG‑3’SEQ ID NO:15F8r5’‑TCATCCGTAATTCCTCAAGT‑3’SEQ ID NO:16F9f5’‑GAGGAATTACGGATGATTACCC‑3’SEQ ID NO:17F9r5’‑ACCAGACAAAGCTGGGTATGA‑3’SEQ ID NO:18以提取的病毒核酸反转录产物为模板，使用引物F1f和F1r扩增得到片段F1；引物F2f和F2r扩增得到片段F2；引物F3f和F3r扩增得到片段F3；引物F4f和F4r扩增得到片段F4；引物F5f和F5r扩增得到片段F5；引物F6f和F6r扩增得到片段F6；引物F7f和F7r扩增得到片段F7；引物F8f和F8r扩增得到片段F8；引物F9f和F9r扩增得到片段F9；所有产物连接T载体得到F1～F9质粒；2)使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物，以F1质粒为模板，扩增得到Ham Rz+F1片段，将Ham Rz+F1片段连接到T载体得到质粒Ham Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物，以F9质粒为模板，通过前后两轮PCR得到F9+HDV Rz片段，连接到T载体得到质粒F9+HDV Rz；3)用引物Infusion_P1和F1r，以质粒Ham Rz+F1为模板；用引物F2f和F2r，质粒F2为模板；用引物F3f和Infusion_P2，质粒F3为模板进行扩增；三个产物依次连接入T载体为FA质粒；引物Infusion_P3和F4r以质粒F4为模板的PCR产物；引物F5f和Infusion_P4以质粒F5为模板的PCR产物，二个产物接入T载体为FB(‑)质粒，然后将质粒FB(‑)和质粒F4经过Sac I和Hpa I双酶切后连接为质粒FB(+)；质粒FB(+)和质粒F7经过Nco I和Hind III双酶切连接成为片段质粒FB；引物Infusion_P5和F8r以质粒F8为模板的PCR产物；引物F9f和Infusion_P6以质粒F9+HDV Rz为模板的PCR产物连接入T载体为FC质粒；引物名称引物序列序列表顺序Infusion_P15’‑GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG‑3’SEQ ID NO:22Infusion_P25’‑CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC‑3’SEQ ID NO:23Infusion_P35’‑GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT‑3’SEQ ID NO:24Infusion_P45’‑CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC‑3’SEQ ID NO:25Infusion_P55’‑GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG‑3’SEQ ID NO:26Infusion_P65’‑CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT‑3’SEQ ID NO:274)将序列为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的Oligo DNA溶解后退火形成双链，然后将pVAX1载体用NheI和ApaI双酶切后胶回收，与双链连接形成载体pVAX2；5)然后将片段FA、FB和FC酶切，再依次连入载体pVAX2得到CDV全基因组感染性克隆pVAX‑rCDV。