[发明专利]一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法

摘要

本发明公开了一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA；(2)标准曲线的构建；(3)荧光核酸恒温扩增检测技术反应。本发明的方法能定量检测稻曲病菌，克服以往第一代LAMP检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，采用不开盖(closed-tube detection technique)就能灵敏地检测反应产物的策略，该方法不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。

主权项

一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法，其特征是，其步骤如下：(1)对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA；(2)标准曲线的构建PCR反应体系为：2.5μL10×PCR buffer，2μL2.5mM dNTPs，0.25μL5U/μL Taq聚合酶，10pM引物uvr1497F/UV‑B3各1μL，1μL提取的水稻稻曲病基因组DNA，补灭菌蒸馏水至25μL；其中，uvr1497F的序列为5′‑CCGCTGCCTAAGATAAAGTCC‑3′，UV‑B3的序列为5′‑CAAGTGCGAGGATAACTGAAT‑3′；PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延长90s、进行35次循环；72℃延长7min；反应结束后，取5μL反应产物，在1％琼脂糖凝胶电泳上分离扩增产物，EB染色观察结果；将PCR扩增产物从凝胶上切取并用试剂盒回收，回收后产物连接到pMD‑18‑T载体，测序验证序列后，将该质粒命名为pMD18‑T‑UV，其浓度为10ng/μL；用该质粒DNA作为模板，10倍梯度系列稀释后用于构建检测稻曲菌的RealAmp标准曲线；RealAmp标准曲线是根据种子中pMD18‑T‑UV的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间Tt；(3)荧光核酸恒温扩增检测技术反应RealAmp反应体系：总体积为25μL，1μL提取并纯化后的样品DNA作为模板，2.5μL10×Bst DNA polymerase buffer、1.0μL浓度为0.2μM的外侧引物UV‑B3和UV‑F3、0.5μL浓度为1.6μM的内侧引物UV‑FIP和UV‑BIP、1μL浓度为8U/μL的Bst DNA polymerase、1.0μL浓度为0.2μMSYTO‑9荧光染料，补灭菌蒸馏水至25μL，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发；其中UV‑F3的序列为5′‑CTTGTGTTTTCCAATGCATGT‑3′，UV‑B3的序列为5′‑CAAGTGCGAGGATAACTGAAT‑3′，UV‑FIP的序列为5′‑ATGCCCGCCAGAATACTGGCGCAGAATTCAGTGAATCATCG‑3′，UV‑BIP的序列为5′‑CCTCAAGCTCTGTCTTGCGACGAGACCGCCGATTCATTT‑3′；RealAmp反应在ESE‑QuantTubeScanner上进行，63℃反应90min，随后在80℃孵育10min以终止反应；反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果。