[发明专利]一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法

摘要

本发明公开了一种转AtWUS基因促进橡胶树(Heveabrasiliensis)侧芽发生的方法，采用拟南芥(Arabidopsisthaliana)WUS(WUSCHEL)基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织进行遗传转化、得到转基因材料，促进了橡胶树侧芽发生，并形成侧枝，验证了AtWUS基因的功能，表明WUS基因对橡胶树侧芽发生、侧枝形成起着重要作用，所取得的侧芽、侧枝有实际应用的潜力。本发明根据植物干细胞决定基因WUS对植物分生组织起关键作用、并促进体细胞胚发生和/或器官发生的性质，利用农杆菌介导法，构建植物表达载体，把AtWUS基因转入橡胶树愈伤组织，得到转基因材料，以期促进橡胶树体细胞胚发生或器官发生，促进形成再生植株或芽条的能力，从橡胶树基因工程这一条新途径服务于应用和生产。

主权项

一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，该转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括：步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301‑35s‑AtWUS植物表达载体；步骤二，根据β‑葡糖醛酸酶(β‑glucuronidase,GUS)基因(uidA)瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；步骤三，以橡胶树品种热研88‑13易碎胚性愈伤组织在含有Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88‑13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88‑13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88‑13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；步骤五，组织化学检测和分子检测，切取14株热研88‑13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88‑13抗性植株和3株对照一起进行分子检测。