[发明专利]一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法

摘要

本发明提供了一种用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种后，再经二次灭菌，培养一段时间后，挑取种子周围的内生真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA 液体培养。用纱布过滤发酵物，将滤液部分用乙酸乙酯萃取。过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明应用真菌培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题，为进行工厂化真菌发酵生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。

主权项

一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，是以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，其特征在于：步骤如下：A、外植体的选择和灭菌处理：以曼地亚红豆杉种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100‑150转摇15‑20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；所用洗洁精浓度为2%～3%，浸泡和冲洗时间为15‑30分钟，0.1%的氯化汞浸泡灭菌时间为9‑14分钟，无菌去离子水冲洗次数为6‑8次；B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，培养时间为3‑5天；至在种子周围有菌丝形成；C、二次灭菌：将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗；二次灭菌时间为8‑12min，无菌水冲洗6‑8次；D、内生菌的诱导：将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌；培养温度为21±2℃，光照强度为1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为7‑10天；E、内生菌培养：将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，然后再挑取部分菌斑置于PDA 液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量；液体培养时，每个三角瓶的接种量为 2%，装液量为 200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为 27℃，转速为 150r / min；F、紫杉醇提取：将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理1次，将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至10mL备用；超声处理时间为25‑35min，滤膜过滤时用0.45μm滤膜；G、紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L；色谱条件为：C18柱：250mm×46mm；流动相，甲醇：水=60：40，v/v；压力：1506PSI=10.39MPa；保护压力：100LO‑Pr；流速0.7mL/ min，检测波长228nm，灵敏度，0.1AUf's，柱温35℃。