[发明专利]MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用

摘要

本发明公开了MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，并公开了以该培养方法培养的MDCK细胞在制备人用流感疫苗和禽流感疫苗中的应用，具体方法为用方瓶或转瓶培养种子细胞，种子细胞消化后接种到备有微载体的生物反应器中放大培养，接种相应的禽流感或流感病毒进行病毒增殖培养，待70%以上细胞产生病变后收获病毒培养液进行常规制苗工艺。本发明的有益效果为：该工艺从根本上解决鸡胚生产中存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染和遇禽流感爆发等工艺缺陷，在对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高疫苗产量和质量，在实际生产中具有应用前景。

主权项

MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）微载体处理：将Cytodex系列微载体用pH为7.4的PBS缓冲液浸泡3‑24h，并清洗两次，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；将GF系列微载体用含有吐温‑80的纯化水浸泡3‑24h，再用pH为7.4的PBS缓冲液清洗后，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用；2）MDCK种子细胞复苏：从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37℃‑39℃的水浴中快速解冻复苏细胞，复苏后用含有牛血清的细胞培养液在方瓶中静置培养至细胞生长到方瓶生长面90%以上致密；3）种子细胞的扩大培养：待步骤2）中的细胞生长到方瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）‑（1：10）的分瓶比例扩大培养至转瓶培养所需的细胞数；再接种到转瓶培养，待细胞生长到转瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1：2）‑（1：10）的分瓶比例扩大培养至生物反应器培养所需的细胞数；4）生物反应器微载体培养：按照每升培养体积内投放2‑25g微载体、每个微载体上接种5‑50个细胞的比例将转瓶培养的MDCK细胞消化后接种到生物反应器中培养至90%微载体表面形成致密单层。