[发明专利]一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法

摘要

本发明公开了一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法，是经样品采集、预处理、扩大培养、逐级梯升温阶筛选、选定耐高温菌群和选定耐高温菌株等步骤分离筛选得到的。由于这种细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。

主权项

一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法，其特征是：包括如下步骤：（1）采集土壤样品：采集地表以下5cm处的土壤为样品；（2）样品预处理：取上述土壤样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震摇10min，静置悬浮液，取上清液离心2min后，取上层菌液为菌悬液，备用；（3）扩大培养：分别取菌悬液10μL接种于250mL LB培养液中，置于37℃恒温箱中培养震荡72h，得扩大菌种培养液；（4）逐级梯升温阶筛选：取10μL扩大菌种培养液接种于250mL LB培养液中，按温度逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液；（5）选定耐高温菌群：在培养温度下，观察接种菌液后的LB培养液，如出现浑浊，则判定该菌可在此温度下生长，反之则排除；（6）选定耐高温菌株：取耐50℃以上的菌液，以生理盐水稀释（10^‑6），并均匀涂布于富氮培养基内，37℃培养48h；挑取有不同形态特征的单菌落，于37℃富氮培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于‑80℃条件下保存；（7）采用尼罗蓝染色法，分别取耐50℃以上具不同形态特征的单菌落，接种于LB培养基培养12h；步骤（6）的耐高温菌株经适当扩繁后稀释（10^‑6）涂布筛选培养基，于30℃条件下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落，即产PHB高的菌株，目标菌株再以富氮培养基37℃扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于‑80℃条件下保存，得耐高温、产PHB高的菌群。