[发明专利]基于AAV‑ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用

摘要

一种基于AAV‑ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用。该微载体包括用于表达外源基因的基因表达框，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列。其中，所述基因表达框优选采用线性表达框，包含在两段ITR序列之间依次分布的CMV增强子、Chickenβ‑actin启动子、多克隆位点和SV40‑Ploy(A)。尤为优选的，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列。该微载体的构建方法包括依次构建含有基因表达微载体序列的质粒pUC57‑minivector、微载体扩增质粒pUC57‑minivector‑EGFP等，经酶切、热变性和冷却处理，获得目标产物。本发明的微载体可以在宿主细胞中高效、稳定持久的表达外源基因，且无副作用，安全性高，同时，其构建方法简单，成本低廉，易于规模化实施，有望在基因治疗或基因工程等领域广泛应用。

主权项

一种基于AAV‑ITR的基因表达微载体在宿主细胞内高效稳定表达外源基因的方法，其特征在于：其中所述基于AAV‑ITR的基因表达微载体包括用于表达外源基因的基因表达框，其中，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列，所述基因表达框为线性表达框，并且所述基因表达框包含在两段AAV基因组的ITR序列之间依次分布的CMV增强子、Chickenβ‑actin启动子、多克隆位点和SV40‑Ploy(A)，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列；其步骤如下：(1)提供AAV‑ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有基因表达微载体序列的质粒pUC57‑minivector，其中，所述基因表达微载体包括两组AAV基因组的ITR序列，该两组ITR序列之间分布有用于表达外源基因的基因表达框；(2)将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57‑minivector，获得微载体扩增质粒pUC57‑minivector‑EGFP，再以pUC57‑minivector‑EGFP为模板，PCR扩增该两组ITR序列中的两组D序列之间的DNA片段，该PCR扩增采用的上游引物序列为5’‑GCGTCTAGAGGTACCCTAGTTATTATTAGTAATC，下游引物序列为5’‑GCG TCTAGATAA AAAACCTCCCACACCTCCC，通过XbaI酶切微载体扩增质粒pUC57‑minivector‑EGFP，并将其与PCR扩增得到的左、右D序列之间的片段连接获得微载体扩增质粒pUC57‑minivector‑ΔD–EGFP；(3)NotI酶切微载体扩增质粒pUC57‑minivector‑ΔD–EGFP，并回收目的片段，而后依次进行热变性和冷却处理，获得不含D序列的所述基因表达微载体；(4)在体外细胞中表达不含D序列的AAV‑ITR的基因表达微载体。