[发明专利]黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法，属于黄曲霉毒素B1的检测领域。本发明利用黄曲霉毒素B1适配体对黄曲霉毒素B1进行识别，利用实时定量PCR对黄曲霉毒素B1适配体的互补DNA链进行扩增作为信号输出，根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B1与扩增循环数之间的线性关系，对黄曲霉毒素B1的含量进行定量分析，实现对黄曲霉毒素B1的识别和检测。本发明在线性、灵敏度、回收率、选择性和重现性等方面做了方法验证，结果证明本发明所建立的黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法具有线性范围好、灵敏度高、选择性好、稳定性强等优点。

主权项

黄曲霉毒素B1的实时定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将AFB1的生物素化的适配体与互补单链DNA链进行杂交，得到混合溶液；(2)将混合溶液加入到吸附或交联有链霉亲和素的PCR管中；(3)将待检测的样品加入到PCR管中，释放出互补单链DNA链；(4)用固定在PCR管表面的互补单链DNA建立RT‑qPCR定量检测体系进行RT‑qPCR扩增反应；(4)根据扩增结果，对样品中AFB1的含量进行定量分析；其中，所述的AFB1的生物素化的适配体的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其3′端连有生物素；所述的互补单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；步骤(2)所述链霉亲和素的浓度为2.5ng mL‑1；步骤(1)所述生物素化的适配体浓度为5.0nM；步骤(1)将AFB1的生物素化的适配体与互补单链DNA链按照1:1的体积比进行杂交；步骤(4)RT‑qPCR定量检测体系中互补单链DNA浓度范围为1×10‑4到10nM；步骤(4)中所述的RT‑qPCR定量检测体系按照以下方式建立：50μL PCR反应体系由以下部分组成：浓度范围1×10‑4到10nM之间的互补单链DNA为5μL，10μM上、下游引物分别添加2μL，25μLPremix Ex1μL 50×ROX Reference Dye II和15μL水；所述上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述的RT‑qPCR反应参数如下：预变性30s 95℃,变性40个循环5s 95℃,退火34s 60℃。