[发明专利]一种芝麻染色体荧光原位杂交方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其采用涂片技术制作芝麻中期染色体标本，染色体分散效果好，制片效率高；在此基础上，采用荧光素标记BAC探针，建立了芝麻BAC的染色体原位杂交技术。探针杂交染色体后，荧光信号可被直接检测，从而确定目的DNA片段在染色体上的拷贝数量及位置。采用本发明方法制作的染色体标本可用于多次重复杂交，提高了标本的利用率和试验效率，并节省大量时间和成本；填补了我国芝麻染色体BAC原位杂交技术的空白。

主权项

一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：A、染色体标本的制备；B、BAC探针制备：1）BAC质粒DNA提取从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA浓度100－500 ng/μL；2）探针标记取20μL BAC DNA，0.1Kpa、120℃下放置5min，然后冰浴放置5min，随机引物法进行探针标记，37℃水浴20h，65℃灭活5min，‑20℃保存备用；标记体系见表1；表1探针荧光标记反应体系C、荧光原位杂交将标记好的探针用杂交液稀释10倍作为工作液用于荧光原位杂交；工作液各组分见表2；表2 荧光原位杂交所用工作液组成1）染色体制片处理将染色体制片浸泡于45%乙酸中1－2min，取出自然晾干，褪去吉姆萨染液颜色；37℃下用含100μg/mL RNase A的2×SSC处理制片标记区1h；然后用2×SSC洗片三次，每次5min；使用70%、85%及无水乙醇对制片逐级脱水，每级3－5min；自然晾干后， 37℃下用1%胃蛋白酶处理制片标记区30min，1×PBS洗2次，每次5min；然后用1%多聚甲醛处理制片标记区10min，2×SSC洗2次，每次5min，自然晾干；在制片标记区加70%去离子甲酰胺，加盖片，70℃变性2min；将变性后的制片进行脱水，依次置于‑20℃预冷的70%、85%及无水乙醇中逐级脱水，每级3－5min，自然晾干备用；2）探针变性取20μL工作液，95℃变性10min，冰浴5min以上，备用；3）杂交制片标记区内加工作液8μL，加盖片，胶水封边，37℃杂交过夜；4）信号检测室温下2×SSC液浸泡制片，洗去盖片，含0.1 wt % SDS的 2 ×SSC浸洗3次，每次5min；然后用蒸馏水冲洗一遍，避光晾干；在制片标记区滴入4μL含4µg/mL DAPI 的Vectashield H1000，加盖片置于Nikon 80i荧光显微镜下，根据制片坐标确定目标染色体，观察杂交信号，冷光源CCD下进行图像采集，采用Spot Rtke 4.1软件进行图像合成，并利用Adobe Photoshop 7.0软件对图像进行调整。