[发明专利]一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒及其构建方法

摘要

本发明属生物医学领域，涉及溶瘤腺病毒，具体涉及一种受组织或细胞特异性启动子(转录水平)和microRNA(转录后水平)双调控的新型溶瘤腺病毒及其构建方法，构建的双调控溶瘤腺病毒比仅受组织或细胞特异性启动子调控的溶瘤腺病毒更加安全、有效；本发明构建的双调控溶瘤腺病毒能单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能显著提高肿瘤治疗效果并减少副作用。

主权项

1.一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，以重组腺病毒(Ad)为载体，根据不同类型肿瘤的遗传特点及转录水平，选择肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子进行调控腺病毒早期复制必需元件E1基因；及根据转录后水平选择肿瘤组织和正常组织差异表达的MicroRNA，设计多个拷贝的靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1的3'非翻译区(3'UTR)，构建形成受转录和转录后水平双调控的溶瘤腺病毒；所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒的构建方法，包括步骤：1)通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子；2)构建携带肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子调控腺病毒早期复制必需元件E1基因的腺病毒穿梭质粒；3)设计MicroRNA靶序列的长度、拷贝数和连接序列，所述MicroRNA为miR‑145，拷贝数为4个，4个拷贝miR‑145靶序列的具体序列结构为gtt aac agg gat tcc tgg gaa aac tgg act cag agg gat tcc tgg gaa aac tgg acc tga agg gat tcc tgg gaa aac tgg act agg agg gat tcc tgg gaa aac tgg acg tt；通过PCR反应或基因合成获得上述MicroRNA靶序列；4)利用分子克隆技术将获得的MicroRNA靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1表达框终止密码与polyA之间；5)构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架质粒；6)包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；7)病毒感染正常细胞及肿瘤细胞测定比较复制及杀伤能力，评价安全性及有效性；所述的微环境特异性启动子选自低氧诱导性基因启动子或热休克蛋白基因启动子。