[发明专利]一种提取及培养脂肪干细胞的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，是一种提取及培养脂肪干细胞的方法，步骤为(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复离心冲洗；(2)将脂肪组织绞碎为1‑2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，(3)静置分层将底层细胞用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；(4)将获得的干细胞按照2‑3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于培养箱中进行培养。该方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性等优点。

主权项

一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；(2)将脂肪组织绞碎为1‑2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中37℃，190rpm消化30min；加入等体积的含有15％FBS的BME培养基终止消化；所述的消化液是浓度分别为0.1％的胰酶‑EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D‑Hank’s平衡盐溶液；(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1：1混合孵育2分钟，4℃、离心力450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞；(4)将获得的干细胞按照2‑3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1‑2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶‑EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；所述培养液由L‑谷氨酰胺1mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml，表皮生长因子5ng/ml，白血病抑制因子5ng/ml，谷胱甘肽10μg/ml，50μg/ml虫草提取物，BME补足至100％组成。