[发明专利]一种含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法

摘要

本发明公开了一种腈水解酶工程菌的高密度发酵方法，该方法采用全新的重组大肠杆菌发酵及补料培养基配方，通过采用DO-STAT偶联分步诱导，并分阶段逐步提高转速的方法，既满足了培养过程中随着生物量增加对搅拌功率的需要，又有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端；此外，通过采用批次补加乳糖的诱导方式，既避免了乳糖浓度过高所引起的发酵液粘度增大，致使传氧、传质受阻问题，又提高了诱导强度，利用本发明的高密度发酵技术，重组大肠杆菌的生物量由10.35g DCW/L提高至70g DCW/L，体积酶活从18205U/L提高至103530U/L，使发酵水平提高了4.7倍。

主权项

一种含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述方法为：将含腈水解酶基因的工程菌经扩大培养获得的种子液以体积浓度2～4％的接种量接种至发酵罐，于37℃、500rpm、通空气比1‑2vvm条件下发酵培养至发酵液溶解氧15％±5％，开始采用DO‑STAT方式添加补料培养基，维持发酵液溶氧值在15％±5％，调整搅拌转速为600～700rpm，发酵至OD₆₀₀达到20～40时，调整温度至25～35℃，加入终浓度10～25g/L乳糖进行第一次诱导；发酵至OD₆₀₀达到70～110后，调整转速至720～780rpm；发酵至OD₆₀₀达110‑130，再次加入终浓度10～15g/L乳糖进行二次诱导；发酵至OD₆₀₀达到115～140后，调整转速至780～850rpm，继续发酵至OD₆₀₀达到150～190后，调整转速至900～1300rpm；维持发酵转速为900～1300rpm、温度25～35℃条件下，继续发酵至OD₆₀₀值以及比酶活在3h内不再上升或开始下降时，停止发酵，放罐，获得发酵液，发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～7.0；所述发酵罐内添加含终浓度50g/L卡那霉素的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～15g/L，NaCl5～15g/L，甘油5～20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3～10g/L，KH₂PO₄ 0.5～3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.0～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～1.0g/L，溶剂为水，pH值为6.0‑7.0；所述补料培养基组成为：蛋白胨50‑120g/L，酵母提取30～80g/L，甘油300～900g/L，柠檬酸1～8g/L，硫酸铵1～10g/L，K₂HPO₄ 1～8g/L，NaCl 1～10g/L，MgSO₄ 1～10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～7.0。