[发明专利]一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法

摘要

本发明公开了一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：（1）人工合成烟草钾离子转运体HAK1基因序列；（2）构建CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1；（3）转化土壤农杆菌和烟草外植体；（4）转基因株系的分化、移栽。本发明既降低了烤后烟叶的糖含量，同时也增加了烟碱含量，有利于生产低糖高烟碱的烟叶原料。

主权项

一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：（1）人工合成烟草钾离子转运体HAK1的基因序列:烟草钾离子转运体HAK1基因为基因银行登录的完整基因序列，登记号：DQ841950；在HAK1基因编码序列的5'和3'两端分别添加XbaI‑BamHI和SacI酶切位点后，送公司常规合成HAK1基因序列；（2）构建CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI‑HAK1：用BamHI和SacI分别双酶切HAK1合成片段和常规的植物表达载体pBI121，把HAK1小片段回收后连接到pBI121大片段上，形成植物表达载体pBI‑HAK1，从而获得CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI‑HAK1，冻融法转化大肠杆菌TG1菌株后保存菌种备用；（3）转化土壤农杆菌和烟草外植体将表达载体pBI‑HAK1用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404菌株中，在含100mg·L‑1 卡那霉素和20 mg·L‑1 利福平的YEP培养基中涂布培养，用灭菌牙签挑取抗性农杆菌单菌落进行菌落PCR检测，PCR扩增目标条带为212bp，扩增引物序列为：      P‑F：5’‑ TTTCCTTTGCGTCAAGTCCG‑3’  P‑R：5’‑ CAAAACTCTGTGCTGGTCCC‑3’挑取PCR阳性的抗性单菌落，在含100mg·L‑1 卡那霉素和20 mg·L‑1 利福平的YEP培养基中28℃振荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体；把烟草无菌苗的鲜嫩烟叶切成直径为0.5mm的叶盘外植体，在重悬的菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上进行暗培养，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L‑1脱菌培养基上培养，直至脱菌完全；（4）转基因株系的分化、移栽将脱菌完全的外植体转接到分化培养基上光照培养，光强为4000lux，14h/d；每20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待烟苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中。