[发明专利]一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法

摘要

本发明涉及疫苗生产技术领域，具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增。利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95％，密度达到5×106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

主权项

一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤：1)种子细胞活化将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5％的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2％的培养基培养2代；2)种子细胞的无血清驯化从2％浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；3)种子细胞在生物反应器中的培养在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度50万/ml)，反应器参数设定为：转速80转/分，培养温度37℃，溶氧为30‑45％，pH值为7.2‑7.4；采用半连续流加方式培养细胞；4)狂犬病毒株的增殖将狂犬病毒株以2％(v/v)比例接种生长良好的单层种子细胞，培养48‑72小时，当病变达到80‑100％时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；5)接种病毒当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种步骤4)获得的狂犬病毒液；6)病毒大规模扩增生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃；7)病毒收获狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒2‑5次之后，细胞活力降低到80％以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，‑80℃保存备用。