[发明专利]十字花科蔬菜根肿病菌DNA的提取方法及应用

摘要

本发明提供了一种十字花科蔬菜根肿病菌DNA的提取方法及应用，十字花科蔬菜根肿病菌样品DNA提取，采用硅藻土方法，隔离了根肿菌寄主DNA，为根肿菌的分子研究奠定了基础。可用于十字花科蔬菜根肿病菌生理小种分离和检测，在植物抗病性鉴定过程中同时使用根肿菌特异的分子标记，进行生理小种特异的抗病性鉴定准确度可达到100%。利用硅藻土法提取十字花科蔬菜根肿病菌DNA重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。

主权项

一种十字花科蔬菜芸薹根肿菌DNA的提取方法，其特征是采用硅藻土法提取根肿菌孢子DNA，具体步骤包括：(1)将1g感病病根压扁，释放出孢子，与50mL的灭菌蒸馏水混匀，16层纱布过滤，滤液再次通过中速滤纸过滤，分装到50mL的离心管中，滤液4500rpm，离心10分钟，弃去上清溶液，沉淀继续用50mL经过灭菌的蒸馏水溶解，滤液4500rpm，离心10分钟，再滤液4500rpm，离心10分钟；将第三次离心获得的沉淀中加入5mL25％(w/v)浓度的蔗糖3100rpm，离心5分钟，倒掉上清液，沉淀重新溶于30mL蒸馏水中，混匀，3100rpm，离心5分钟；沉淀用30mL蒸馏水悬浮，即获得根肿病菌孢子悬浮液；将制备的浓度≥108个的孢子悬浮液4000rpm，离心5分钟，去掉上清液，沉淀用1mL灭菌的蒸馏水悬浮，4℃保存，用于DNA提取；(2)在含有1mL根肿病菌孢子悬浮液的离心管中加入200μL异硫氰酸胍缓冲液混匀，其中，50mL异硫氰酸胍缓冲液含0.2M异硫氰酸胍，0.25gEDTA，40mM Tris‑HCl室温放置10分钟，8000rpm，离心30秒；(3)将上清液转入另一离心管中，加入20mg/mL RNA酶，37℃水浴30分钟；(4)加入30μL硅藻土吸附液，震荡均匀后室温放置15分钟，13000rpm，离心30秒，弃去上清液；硅藻土吸附液中1g硅藻土与1×TE缓冲液比例为1∶1(w/v)混合，其中，1×TE缓冲液含10mM Tris‑Hcl和1mM EDTA，(5)沉淀中继续加入200μL异硫氰酸胍缓冲液，混匀后室温放置10分钟，8000rpm，离心30秒，弃上清；(6)用洗涤缓冲液，洗涤沉淀3次，每次300μL，然后用200μL70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，13000rpm，离心2分钟，弃上清，沉淀在室温放置1小时；其中，每500mL洗涤缓冲液含60％(v/v)乙醇，20mM Tris‑HCl，EDTA0.25g，400mM NaCl；(7)向沉淀中加入30μL蒸馏水，在涡旋振荡器上充分混匀，55℃水浴10分钟，13000rpm，离心5分钟，上清液即为DNA提取液；(8)分别利用分子标记TCR01和TC01进行PCR扩增，以扩增产物中是否含有寄主的部分PCR片段来识别样品中是否含有寄主DNA污染。