[发明专利]冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒和方法，其中该试剂盒包括：第一冷冻工作液，所述第一冷冻工作液含有第一诱导多能干细胞培养基、乙二醇以及二甲基亚砜；以及第二冷冻工作液，其中，所述第二冷冻工作液含有第二诱导多能干细胞培养基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，并且在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量是在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量中的两倍。利用该试剂盒冻存iPSC安全有效，解冻后iPSC复苏率高，多次培养传代能维持正常的核型，保持其特性。

主权项

1.一种冷冻保存诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法采用一种用于冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒进行，所述试剂盒包括：第一冷冻工作液，所述第一冷冻工作液含有第一诱导多能干细胞培养基、乙二醇以及二甲基亚砜；以及第二冷冻工作液，其中，所述第二冷冻工作液含有第二诱导多能干细胞培养基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，并且在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量是在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量中的两倍，进一步包括：第一解冻液，所述第一解冻液含有第三诱导多能干细胞培养基和蔗糖；以及第二解冻液，所述第二解冻液含有第四诱导多能干细胞培养基和蔗糖，其中，在所述第一解冻液中蔗糖的浓度是在所述第二解冻液中蔗糖的浓度的两倍，所述第一至第四诱导多能干细胞培养基分别独立地为选自mTeSRTM1、mTeSRTM2和E8培养基中的任意一种，在所述第一冷冻工作液中，乙二醇的含量为10体积％，二甲基亚砜的含量为10体积％，剩余为所述第一诱导多能干细胞培养基；以及在所述第二冷冻工作液中，乙二醇的含量为20体积％，二甲基亚砜的含量为20体积％，蔗糖的含量为0.3M，剩余为所述第二诱导多能干细胞培养基，在所述第一解冻液中，蔗糖的含量为0.2M，其余为所述第三诱导多能干细胞培养基；以及在所述第二解冻液中，蔗糖的含量为0.1M，其余为所述第四诱导多能干细胞培养基，进一步包括：封闭式玻璃化冷冻组件，所述方法包括：(1)将选自mTeSRTM1、mTeSRTM2和E8培养基中的任意一种、第一冷冻液和第二冷冻液各0.5ml分别加入到四孔板的三个孔中；(2)将所述四孔板在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中静置以便平衡至少1小时；(3)将待保存的诱导多能干细胞加入到所述四孔板中含有选自mTeSRTM1、mTeSRTM2和E8培养基中的任意一种的孔中，放置1分钟；(4)将所述待保存的诱导多能干细胞从所述含有选自mTeSRTM1、mTeSRTM2和E8培养基中的任意一种的孔中转移至所述四孔板中含有所述第一冷冻液的孔中放置1分钟，同时利用第二冷冻液制作体积为20微升的液滴；(5)将所述待保存的诱导多能干细胞从所述含有第一冷冻液的孔中转移至所述四孔板中含有所述第二冷冻液的孔中放置25秒后，将所述待保存的诱导多能干细胞转移至所述体积为20微升的液滴，以便得到含有诱导多能干细胞的液滴；(6)将所述含有诱导多能干细胞的液滴装载于封闭式冷冻环上，并将所述封闭式冷冻环接触预先经过冷却的金属块表面，在所述液滴凝固后装入塑料套管中，封口后放置于液氮中进行保存。