[发明专利]聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法

摘要

一种聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法。包括以下步骤：将表达葡激酶突变体Sak-E80C的工程菌接种诱导培养收集上清液；将上清液加入到阳离子交换层析柱中进行洗脱，收集洗脱组分；用Bradford法测定收集液中Sak-E80C的浓度，然后将Sak-E80C、羟基-马来酰亚胺聚乙二醇在室温下反应，修饰完成后，将修饰反应液加入阳离子交换层析柱中进行洗脱，收集相应组分；将收集液加入到凝胶过滤层析柱中，用缓冲液进行冲洗,分别收集两个主要洗脱峰；将获得的含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到阴离子交换层柱中进行洗脱并收集相应组分，将含有Sak-E80C-HPG的收集液分装，进行冷冻干燥。

主权项

一种聚乙二醇‑葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将表达葡激酶突变体Sak‑E80C的工程菌接种于液体培养基中，37℃培养6h后，升温至42℃诱导培养4h，然后，4℃、5000 rpm离心10 分钟收菌，弃上清，用pH=5‑6、含有0.01M EDTA和0.01M二硫苏糖醇的0.02M NaAC‑HAC缓冲液，悬浮菌体进行超声破碎，破碎后4℃、12000 rpm高速离心20 min，收集上清液；（2）将上清液pH调至5.6，加入到SP‑Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.7×30 cm）中，然后用pH=5‑6、含有80‑1000mM NaCl和0.01M二硫苏糖醇的10‑50mM NaAc‑HAc缓冲液进行洗脱，分别收集洗脱组分，用SDS‑PAGE电泳分析，以确定突变体葡激酶Sak‑E80C所在的洗脱峰，从而确定含Sak‑E80C的收集液；将含Sak‑E80C的收集液加入到Sephadex G‑50凝胶过滤层析柱（3.8×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=5‑6、含0.01M二硫苏糖醇的10‑50mM NaAc‑HAc缓冲液进行冲洗，收集相应组分，用SDS‑PAGE电泳分析，以确定含Sak‑E80C的收集液；（3）用Bradford 法测定收集液中Sak‑E80C的浓度，然后按照摩尔比，Sak‑E80C：羟基‑马来酰亚胺聚乙二醇 =1:（3‑10），在室温下，反应进行3‑5小时，修饰完成后，用SDS‑PAGE电泳和SEC‑HPLC分析聚乙二醇‑葡激酶偶联物(HO‑PEG‑MAL‑Sak‑E80C；Sak‑E80C‑HPG)的产率；将修饰反应液加入SP‑Sepharose FF阳离子交换层析柱（2.6×25 cm）中，然后用pH=5‑6、含有100‑200mM NaCl 的10‑50mM NaAc‑HAc缓冲液进行洗脱，收集相应组分；    将SP‑Sepharose FF阳离子交换层析获得的收集液加入到 Toyopearl HW‑50F凝胶过滤层析柱（2.6×100 cm）中，上样量为凝胶体积的5%，然后用pH=8‑9、10‑50mM Tris‑HCl缓冲液进行冲洗, 分别收集两个主要洗脱峰，用SDS‑PAGE电泳显示，其中一个洗脱峰主要成分为聚乙二醇‑葡激酶偶联物（HO‑PEG‑MAL‑ Sak‑E80C‑HPG；Sak‑E80C‑HPG），另一洗脱峰主要为未被修饰的Sak‑E80C； 将含有Sak‑E80C‑HPG的收集液加入到 Q‑Sepharose FF阴离子交换层柱（1.5×15 cm）中，然后用pH=8‑9、含有100‑200mM NaCl 的10‑50 mM Tris‑HCl缓冲液进行洗脱，收集相应组分，用SDS‑PAGE电泳分析，以确定含有Sak‑E80C‑HPG的收集液，最后将含有Sak‑E80C‑HPG的收集液分装，进行冷冻干燥得到产品。