[发明专利]一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体及其构建方法

摘要

一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体,其构建方法:1. 制备含有博莱霉素抗性基因的DNA片段的博莱霉素抗性基因Ble resistant。2. 制备终止子Ter；3.以启动子Ph5‑rb为模板，扩增产物经纯化后连入pMD18‑T simple载体中，得中间重组载体pJD1；4.酶切载体pJD1，回收载体大片段A；酶切终止子Ter，回收302bp片段；将所述载体大片段A与所述302bp片段连接，得重组载体；5.酶切载体pJD12，回收载体大片段B；酶切博莱霉素抗性基因Ble resistant，回收1170bp片段；将该片段与所述的载体大片段B连接、转化，得到目的表达载体Dh5α/pJD124。

主权项

1.一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体Dh5α/pJD124, 保藏号为：CCTCC M2014394；其特征在于，所述的Dh5α/pJD124，由如下步骤得到：（1） 以初始载体质粒pH124为模板， BleF和BleR为引物，进行PCR扩增，得到含有博莱霉素抗性基因的DNA片段的博莱霉素抗性基因Ble resistant；（2） 以初始载体质粒pH124为模板，RBCSTF和RBCSTR为引物，进行PCR扩增，获得终止子Ter；（3）以启动子Ph5-rb为模板，ProF和ProR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物经纯化后连入pMD18-T simple载体中，得到中间重组载体，记作pJD1；（4） 用EcoRI和BamHI酶切载体pJD1，回收载体大片段A；用EcoRI和BamHI酶切终止子Ter，回收302bp片段；将所述载体大片段A与所述302bp片段连接，得到重组载体，记作pJD12；（5） 用BamHI和NotI酶切载体pJD12，回收载体大片段B；同样用BamHI和NotI酶切博莱霉素抗性基因Ble resistant，回收1170bp片段；将该片段与所述的载体大片段B连接、转化，得到重组载体，记作pJD124，即为目的表达载体Dh5α/pJD124;共同表达GFP基因和RED基因的载体pJD124-GFP-RED的构建方法如下：（1）以载体pEGFP-N1为模板，F1和R1为引物扩增GFP基因，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化;（2）用HindIII和EcoRI酶切已纯化的GFP扩增产物，并回收730bp片段；用HindIII和EcoRI酶切载体pJD124，回收大片段；将回收的载体大片段与730bp片段连接、转化，得到重组载体，记作pJD124-GFP;（3）以载体pDsRed1-N1为模板，F2和R2为引物扩增DsRed基因，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化;（4）用HindIII和EcoRI酶切已纯化的DsRed扩增产物，并回收680bp片段；用HindIII和EcoRI酶切载体pJD124，回收大片段；将回收的载体大片段与680bp片段连接、转化，得到重组载体，记作pJD124-Red;（5）用BglII和NotI酶切载体pJD124-RED，切胶回收2640bp的DNA片段，同时用NotI和BglII酶切载体pJD124-GFP，切胶回收4300bp的大片段;（6）将回收的4300bp载体片段与2640bp的DNA片段按照摩尔比1:3的比例混合，再经T4DNA连接酶连接并转化后获得重组载体，记作pJD124-GFP-RED,该载体能够在莱茵衣藻细胞核中同时表达GFP基因和DsRed基因。