[发明专利]基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒

摘要

本发明涉及一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒。所述方法包括：第一轮扩增、消化引物、第二轮扩增、混合、回收、测序、分析。在本发明中，第一轮扩增采用通用序列+各个基因的特定引物组成的混合物，此时多重扩增起作用的是每个基因的特定序列，每个基因前面都加上了通用序列；第二轮扩增引物采用标签序列+通用序列，此时扩增起作用的是通用序列，最后的产物前面又都加上了可识别的标签序列。通过对每个样本都引入独特的引物标签序列，使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的引物标签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。

主权项

1.一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL 5个基因的外显子的试剂盒，其中，所述外显子为SDHB‑EXON1、SDHB‑EXON2、SDHB‑EXON3、SDHB‑EXON4、SDHB‑EXON5、SDHB‑EXON6、SDHB‑EXON7、SDHB‑EXON8、SDHC‑EXON1、SDHC‑EXON2、SDHC‑EXON3、SDHC‑EXON4、SDHC‑EXON5、SDHC‑EXON6、SDHD‑EXON1、SDHD‑EXON2、SDHD‑EXON3、SDHD‑EXON4、RET‑EXON10、RET‑EXON11、RET‑EXON13、RET‑EXON14、RET‑EXON15、RET‑EXON16、VHL‑EXON1、VHL‑EXON2和VHL‑EXON3；所述试剂盒包括以下引物：第一轮扩增引物包括：SDHB‑1F TGTAAAACGACGGCCAGTCTATTGCGCACGCTCGCTGTSDHB‑1R CAGGAAACAGCTATGACCCCCATCAGCTCCAGGCAGTCSDHB‑2F TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGTGTCACTAGCCCCTASDHB‑2R CAGGAAACAGCTATGACCAAACAGAGCCATCGGATGATSDHB‑3F TGTAAAACGACGGCCAGTGAACGTTACATAAATACCACTGGASDHB‑3R CAGGAAACAGCTATGACCCTATCAGCTTTGGCCAGCSDHB‑4F TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGAGAAAAGCCAACAGSDHB‑4R CAGGAAACAGCTATGACCAGGAGCCTTAAATACTCAAACASDHB‑5F TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAAAGAGTCTGGCTTCTGCSDHB‑5R CAGGAAACAGCTATGACCTGCCAGTTCCTCTCCAGAATSDHB‑6F TGTAAAACGACGGCCAGTTCACCCCTTGGATTTTGCTASDHB‑6R CAGGAAACAGCTATGACCGACTGGATGGCAATGAAGGASDHB‑7F TGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGATGAGGCATCTAAGCSDHB‑7R CAGGAAACAGCTATGACCCCCCTAGGCTCACACTGAAASDHB‑8F TGTAAAACGACGGCCAGTTTTGAGGGACTTGATTTGCATSDHB‑8R CAGGAAACAGCTATGACCCGGCAAGTAAAGGAACAGGTSDHC‑1F TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAACCAGCTAGGCAGAGSDHC‑1R CAGGAAACAGCTATGACCGACGGGAAAAGGGGTCTCTASDHC‑2F TGTAAAACGACGGCCAGTGAAAATGGTATCAAGGACACTGASDHC‑2R CAGGAAACAGCTATGACCAATGGCGTGAACCCAAGASDHC‑3F TGTAAAACGACGGCCAGTTTACAGGCCTGAGCAACCATSDHC‑3R CAGGAAACAGCTATGACCTACCCTGAAGGGTTCACCTCSDHC‑4F TGTAAAACGACGGCCAGTACAGGAATGCAAAAGCTGGTSDHC‑4R CAGGAAACAGCTATGACCTCAAGTGCTGAGTTTCAAAGGASDHC‑5F TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGGGTCCCAGTTTTATGTSDHC‑5R CAGGAAACAGCTATGACCGAGCGAGACTCCACTCTTGGSDHC‑6F TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGTGGGGCATAAGGGTAGSDHC‑6R CAGGAAACAGCTATGACCTGCTCCAAGGAGATCTGAAAASDHD‑1F TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCTCGACTTCCGACASDHD‑1R CAGGAAACAGCTATGACCCCTTCGGGTAAACATCTGGASDHD‑2F TGTAAAACGACGGCCAGTACATGCAGATGTTCCCTGGTSDHD‑2R CAGGAAACAGCTATGACCTGTCTGCCCAAAGGTGTAAASDHD‑3F TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTTGTGCTAAAAGACTTCAAASDHD‑3R CAGGAAACAGCTATGACCTCAACAAATTTAGGGCATTTCASDHD‑4F TGTAAAACGACGGCCAGTTGATGTTATGATTTTTTCTTTTTSDHD‑4R CAGGAAACAGCTATGACCCAATTCTTCAAAGTATGAAGTCARET‑10F TGTAAAACGACGGCCAGTTATGCTTGCGACACCAGTTGRET‑10R CAGGAAACAGCTATGACCAGAGGGAGGGAGGGAAGTTTRET‑11F TGTAAAACGACGGCCAGTATGAGGCAGAGCATACGCAGRET‑11R CAGGAAACAGCTATGACCAGAGGAGTAGCTGACCGGGARET‑13F TGTAAAACGACGGCCAGTAGCCTCAAGCAGCATCGTCTRET‑13R CAGGAAACAGCTATGACCGGCAGGAGCAGTAGGGAAAGRET‑14F TGTAAAACGACGGCCAGTGCTGAGGCTTCAAGGTCTGCRET‑14R CAGGAAACAGCTATGACCAGAGCCATATGCACGCACCTRET‑15F TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTGACGACTCGTGCTATRET‑15R CAGGAAACAGCTATGACCCCACTAATCTTCGGTATCTTTCCRET‑16F TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCCTTCAAAGATGTGTGTRET‑16R CAGGAAACAGCTATGACCGCTAGCACTGCAGACAGGTVHL‑1F TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTCTGGATCGCGGAGGGAATVHL‑1R CAGGAAACAGCTATGACCGCTGGGTCGGGCCTAAGCGCCGGVHL‑2F TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGCTCTTTAACAACCTTTGCVHL‑2R CAGGAAACAGCTATGACCCCTGTACTTACCACAACAACCTTVHL‑3F TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCTTGTACTGAGACCCTAGTVHL‑3R CAGGAAACAGCTATGACCAGCTGAGATGAAACAGTGTAAGT第二轮扩增引物包括选自下列正向标签引物和反向标签引物组成的一对或多对：Index_01_F ATCACGTGTAAAACGACGGCCAGTIndex_01_R ATCACGCAGGAAACAGCTATGACCIndex_02_F CGATGTTGTAAAACGACGGCCAGTIndex_02_R CGATGTCAGGAAACAGCTATGACCIndex_03_F TTAGGCCTGTAAAACGACGGCCAGTIndex_03_R TTAGGCCCAGGAAACAGCTATGACCIndex_04_F TGACCATGTAAAACGACGGCCAGTIndex_04_R TGACCACAGGAAACAGCTATGACCIndex_05_F ACAGTGTGTAAAACGACGGCCAGTIndex_05_R ACAGTGCAGGAAACAGCTATGACC其中，所选择的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量×反向标签引物的数量≥样本数量。