[发明专利]一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法

摘要

本发明公开了一种将外源基因定点整合到哺乳类动物靶标基因的方法，利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到靶标基因，特别是将Cre基因定点整合到小鼠Enpp1基因第一个外显子内，该技术不仅整合效率高(20％)；操作步骤简单，仅需构建一个外源基因载体；同时不存在位置效应影响。

主权项

一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将外源基因扩增后连接至外源基因重组表达载体上，构建重组外源基因载体；(2)将靶标基因跟载体连接，构建重组靶标基因载体；(3)将重组外源基因载体与重组靶标基因载体分别经过AatII和SphI酶切、琼脂糖凝胶回收，获得外源基因‑靶标基因片段；(4)以px330质粒为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9‑F和引物Cas9‑R作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME‑T载体连接，获得质粒pGEM‑Cas9，再将质粒pGEM‑Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(5)根据靶标基因序列，人工合成含T7启动子序列的sgRNA，即片段T7‑sgRNA，再将片段T7‑sgRNA克隆到pGME‑T载体，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7‑sgRNA‑靶标基因mRNA；(6)将Cas9mRNA、T7‑sgRNA‑靶标基因mRNA和外源基因‑靶标基因片段混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将外源基因定点整合到靶标基因的目的；Cas9‑F：5’‑TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC‑3’Cas9‑R：5’‑GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC‑3’。