[发明专利]一种人源溶菌酶蛋白纯化方法

摘要

本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose MMC Diamond捕获；Bestdex G‑25缓冲液置换；浓缩目的蛋白。本发明建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺，步骤少、成本低，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。

主权项

1.一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括以下步骤：1)发酵液的前处理，包括去除人溶菌酶溶液中的固体杂质和调整酸碱度，将含重组人源溶菌酶的发酵液调pH至6.5；去除杂质时，先将溶液离心，收集上清，然后使用中空纤维超滤膜处理上清液，进一步除去样品中的小颗粒物质；2)Bestarose MMC Diamond捕获，加入Bestarose MMC Diamond洗脱缓冲液B，调节样品电导使其与平衡缓冲液A电导一致，达到43ms/cm,即为Bestarose MMC Diamond柱上样原样，Bestarose MMC Diamond捕获需要根据目标产品的理化性质，选择合适的色谱条件，用阳离子交换介质作为人溶菌酶的纯化介质,采用的层析柱和缓冲液的条件如下：层析柱：BXK 50/30，Vt＝300mL；平衡缓冲液A：0.4M NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5；洗脱缓冲液B：1.5M NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5；平衡缓冲液A平衡5个柱体积，至层析柱流出液的pH、电导与平衡缓冲液一致，将上述处理后的上样原样以30mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓冲液A清洗3～5个柱体积直到基线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱，然后用洗脱缓冲液B洗脱目的蛋白，根据UV280洗脱峰收集样品；3)Bestdex G‑25缓冲液置换，浓缩前对样品进行缓冲液置换，使其电导小于10ms/cm，采用的层析柱和缓冲液的条件如下：层析柱：BXK 200/500，Vt＝5L；平衡缓冲液：20mM NaAC，pH4.75；平衡缓冲液平衡2 个柱体积，至层析柱流出液的pH、电导与平衡缓冲液一致，将Bestarose MMC Diamond 洗脱样品以200mL/min 流速上样，上样体积小于1.5L，上样结束后继续用平衡缓冲液清洗，根据UV280 峰收集样品；4)浓缩目的蛋白，采用SP Bestarose FF柱进行样品浓缩，采用SP Bestarose FF柱进行样品浓缩的步骤包括：平衡缓冲液平衡3～5个柱体积，至层析柱流出液的pH、电导与平衡缓冲液一致，将置换过缓冲液的样品以20mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗3～5个柱体积直到基线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱，然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，根据UV280洗脱峰收集样品，采用的层析柱和缓冲液的条件如下：层析柱：BXK 50/30，Vt＝280mL；平衡缓冲液：20mM醋酸钠，pH4.75；洗脱缓冲液：0.15M NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH7.5。