[发明专利]一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物

摘要

本发明申请鉴于眼镜蛇蛇毒成分的复杂性和科博肽为碱性多肽、分子量大约7000道尔顿左右、相对耐热耐酸碱等理化性质，综合考虑各种层析柱填料的分离机理、应用特点、长期使用的稳定性、成本的可控性以及提取目标的达成，提供一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法，该方法工艺稳定、层析填料易得、综合成本低、操作条件适应性好、神经毒素的收率高。本发明申请进一步提供由上述方法制备得到的高纯度科博肽，用它制成的注射用科博肽制剂中与治疗作用无关的杂质少、治疗作用起效快、疗效稳定。本发明申请还提供几种以高纯度科博肽为有效成分，配方制成制剂所必要的制剂辅料的药物组合物及不同的剂型，适合口服、口腔吸收、直肠给药的科博肽制剂。

主权项

一种高纯度科博肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，。室温或低温离心，取上清液，待上柱层析；2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC‑HAC、Tris‑HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液在低温透析后待上样；3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液低温透析后待上样；4)将步骤3)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液低温透析后，把透析液装入阻断分子量为5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋浓缩待上样；5)将步骤4)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G‑50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽；或所述的高纯度科博肽的提取方法，包括下述步骤：1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，离心，取上清液，待上柱层析；2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC‑HAC、Tris‑HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液在低温透析后待上样；3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液在低温透析、浓缩后待上样，4)将步骤3)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G‑50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液低温透析后待上样；5)将步骤4)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris‑HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽。