[发明专利]一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法

摘要

本发明涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：⑴油菜及其近缘植物干种子加石英砂研成粉末后加提取液，研磨成匀浆；⑵匀浆装入离心管，并水浴保温以充分裂解；⑶离心管冰浴冷却后加氯仿-异戊醇，混匀至不分层，离心得到上清液A；⑷上清液A中加NaCl，摇匀后加预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物A；⑸沉淀物A中加NaCl，待沉淀物溶解后再加氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后离心，得到上清液B；⑹上清液B中加NaCl和预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物B；⑺沉淀物B中加乙醇，洗涤沉淀后自然风干，加入TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。本发明操作简便、实用，易于实施。

主权项

一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5 ~1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500~700 µL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得：①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；③将50 mL所述0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL所述0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris‑HCl 缓冲液；④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；⑦在所述混合液中依次加入90~100 mL所述0.05mol/L Tris‑HCl 缓冲液、40~50mL 所述0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得；⑵所述匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15~20 min， 每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500~700 µL氯仿‑异戊醇，混匀至不分层，以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A；⑷在300~400 µL所述上清液A中加入150~200 µL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700~800 µL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A；⑸在所述沉淀物A中加入300~400µL、1 mol/L 的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入300~400 µL氯仿‑异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B；⑹在300~400µL所述上清液B中依次加入30~40µL、1 mol/L 的NaCl和800~900 µL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B；⑺所述沉淀物B中加入体积浓度为70~75%的乙醇300~400 µL，洗涤沉淀2~3次后自然风干该沉淀物B，然后加入50~100μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。