[发明专利]一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法

摘要

本发明涉及一种逆转录miR‑505的茎环引物的设计方法，包括：以miRNA‑505‑3P基因为特异性的转录本，分别将该逆转录茎环引物的茎部碱基对的数量和环部的碱基个数规律的设计对应的几个梯度，经过对miRNA‑505‑3P的逆转录和real time‑PCR检测，最终筛选出一个对于miRNA‑505‑3P基因特异性逆转录时效率最佳的逆转录茎环引物。本发明避免了对成熟体检测的干扰，通过茎环引物在茎部和环部的梯度性的调整，可以分别明确的看出环部碱基的结构和茎部碱基的结构分别对逆转录茎环引物的逆转录效率的影响，因此更容易设计出合理高效的逆转录引物。

主权项

一种逆转录miR‑505的茎环引物的设计方法，包括：(1)通过以5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCGCACTGGATACGAC‑3’作为基本骨架，固定茎部为14对互补碱基，设计环部结构分别为15、18、21个不互补碱基的3个梯度，并在3’端加上与miR‑505‑3P成熟序列3’端的10个碱基反向互补序列5’‑AGAAAACCAG‑3’，构成特异性逆转录miRNA‑505‑3P基因的茎环引物；其中，茎环引物分别为：5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG‑3’5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG‑3’5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG‑3’；(2)通过以5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCGCACTGGATACGAC‑3’作为基本骨架，固定环部为21个不互补碱基，设计茎部结构分别为5、8、11、14对互补碱基的4个梯度，并在3’端加上与miR‑505‑3P成熟序列3’端的10个碱基反向互补序列5’‑AGAAAACCAG‑3’，构成特异性逆转录miRNA‑505‑3P基因的茎环引物；其中，茎环引物分别为：5’‑AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG‑3’5’‑TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG‑3’5’‑GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG‑3’5’‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG‑3’；(3)设计real time‑PCR的扩增引物；其中，上游引物5′‑GCGAGCACCGTCAACACTTG‑3′，下游引物5′‑TGCAGGGTCTGACTTATT‑3′；(4)采用(1)和(2)中的茎环引物将mir‑505‑3P基因逆转录为cDNA；进行real time‑PCR的检测；PCR产物进行电泳检测；(5)将(4)中得到的与(1)和(2)中茎环引物相对应的结果进行比对，然后进行real time‑PCR的二次检测，确定逆转效率最佳的茎环引物。