[发明专利]一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法

摘要

本发明公开了一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，属于发酵技术领域。本发明采用甘露醇混合流加、两步式甲醇流加等策略高密度发酵不同葡萄糖氧化酶毕赤酵母工程菌株，建立了一种能够有效提高葡萄糖氧化酶生产的方法。使用该策略，重组菌株PP‑G‑GCN4在甘露醇与甲醇混合比例为120、两阶段甲醇控制量1.8‑1.2％时，在3L发酵罐上酶活1634.7U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

主权项

一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，以甲醇诱导的醇氧化酶启动子启动GOD表达，在诱导产酶阶段分时段控制不同甲醇浓度，当菌体浓度达到90‑100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期前期，醇氧化酶活性升高并趋于平稳，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0‑18.0g/L，诱导期中后期，醇氧化酶开始活性下降，控制发酵体系中残余甲醇浓度11.0‑12.0g/L；所述方法，具体是：当菌体浓度达到90‑100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期0‑60h时，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0‑18.0g/L，诱导60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至11.0‑12.0g/L；在诱导产酶期分时段控制甲醇诱导浓度的同时，流加甘露醇，甘露醇：甲醇的质量比为1:20；将黑曲霉GOD基因连接载体pPIC9K，转化Pichia pastoris GS115，得到工程菌株PP‑GOD；将毕赤酵母中GCN4基因克隆连接到去除了pGAPZαA的α‑mating信号肽的载体pGAPZ，转化入工程菌株PP‑GOD，与GOD共表达，得到工程菌株PP‑G‑GCN4，用于高密度发酵产GOD。