[发明专利]一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法

摘要

本发明公开了一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法。该方法包括如下步骤：选择混合样品中的各物种进化速率适中的基因进行引物设计；根据相应模板和引物的单重PCR优化多重PCR条件；采用优化的条件对已知组分含量比的不同样品DNA进行扩增；通过测定多重PCR产物的熔解曲线，得出组分相应的熔解峰峰高值，将峰高比值与对应的样品组分含量比绘制标准曲线；对于组分含量比未知的样品，采用相同的条件进行扩增和熔解曲线测定，得出峰高比值，然后根据标准曲线计算出相应的组分含量比。本发明简便、快捷、成本低，无需对所有待测模板建立高质量标准曲线的基础之上，实现对物种混合型样品中各物种或组分的定量分析。

主权项

一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：包括如下步骤：(1)引物设计：对混合样品中的各物种的基因组序列进行同源性比对分析，在进化速率适中的基因区段中进行引物设计；所设计的引物不会引发可能影响熔解曲线定性定量分析的非特异性扩增；几种目的扩增产物的T_m差值须大于仪器对多重T_m的区分能力；(2)多重PCR条件的优化：通过相应模板和引物的单重PCR考察每种模板引物的PCR条件，找到引物特异性发挥的最佳退火条件和扩增效率相近的反应条件；保证在各模板扩增到达平台期之前结束扩增；(3)获得多重PCR中模板初始量比值与熔解曲线峰高比值的线性关系：采用(2)中探索出的条件对已知组分含量比的不同样品DNA进行扩增；通过测定多重PCR产物的熔解曲线，得出组分相应的熔解峰峰高值，将峰高比值与对应的样品组分含量比绘制标准曲线；对于组分含量比未知的样品，采用相同的条件进行扩增和熔解曲线测定，得出峰高比值，然后根据标准曲线计算出相应的组分含量比。