[发明专利]梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法

摘要

梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法，涉及梅毒螺旋体。试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、6种不同浓度的梅毒螺旋体特异性抗体校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、6种不同浓度的梅毒螺旋体特异性抗体校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内。制备方法：先后制备梅毒螺旋体特异性重组抗原、重组抗原包被微孔板、天然膜蛋白单克隆抗体、单克隆抗体的碱性磷酸酶标记、发光底物、洗涤液、校准品，最后组装梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒。可用于临床标本中梅毒特异性的定量检测，可作为梅毒治疗效果和预后的客观指标。

主权项

梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶内装有碱性磷酸酶标记单克隆抗体，发光底物瓶内装有发光底物，梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶内装有梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品，500mIU/mL校准品瓶内装有500mIU/mL校准品，200mIU/mL校准品瓶内装有200mIU/mL校准品，50mIU/mL校准品瓶内装有50mIU/mL校准品，10mIU/mL校准品瓶内装有10mIU/mL校准品，0mIU/mL校准品瓶内装有0mIU/mL校准品，洗涤液瓶内装有洗涤液；所述制备方法，包括以下步骤：1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47；2)制备重组抗原包被微孔板将步骤1)中的梅毒螺旋体重组抗原TPN17和TPN47用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒，制备重组抗原包被微孔板，密封备用；3)制备天然膜蛋白单克隆抗体提取梅毒螺旋体标准株Nichols株的膜蛋白，免疫Babl/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术，筛选梅毒螺旋体特异性蛋白TPN17和TPN47的单克隆抗体；所述梅毒螺旋体标准株Nichols株为Treponema pallidum ssp.pallidum strain Nichol；4)单克隆抗体的碱性磷酸酶标记碱性磷酸酶经过碘酸钠活化，分别与步骤3)单克隆抗体分子的‑NH2偶联，形成碱性磷酸酶标记单克隆抗体；5)发光底物制备人工合成金刚烷胺类发光底物及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液；6)洗涤液制备洗涤液为溶有Tween‑20的磷酸盐缓冲液，其中Tween‑20的终浓度为0.01％；7)校准品将高值梅毒螺旋体特异性抗体用校准品稀释液稀释，用国家标准品重复标定三次，三次标定值，取均值作为标定的梅毒螺旋体特异性抗体浓度；所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠和3％牛血清白蛋白组成，pH值7.4；梅毒螺旋体特异性抗体标准品浓度系列1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃或‑20℃存放备用；8)制备梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒将碱性磷酸酶标记单克隆抗体、发光底物、洗涤液、校准品装入瓶中，再将碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、洗涤液瓶、校准品瓶和重组抗原包被微孔板装入外包装盒中，组成梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒，所述校准品包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度。