[发明专利]一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法

摘要

本发明公开了一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，是以两种单糖为起始底物，通过多酶体系的偶联，合成透明质酸。本发明方法偶联了以单糖为底物的糖核苷酸的酶法合成和以糖核苷酸为底物的透明质酸酶法合成，该方法使用单糖为起始底物，价格低廉，容易获得，避免了价格昂贵的糖核苷酸的供给，大大降低了酶法合成透明质酸的生产成本，同时，多酶偶联合成透明质酸能够有效避免透明质酸微生物发酵生产工艺中内毒素残留的弊端。本发明方法工艺简单，条件温和，易于操作，无污染，适合于透明质酸的大规模合成，具有极大的应用前景。

主权项

一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，步骤是：(1)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的N‑乙酰氨基葡萄糖溶液和浓度为0.1M葡萄糖醛酸溶液，备用；(2)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液和浓度为0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液，备用；(3)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度均为50mg/mL的N‑乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N‑乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液、透明质酸合酶溶液，备用；(4)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的N‑乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按体积比1:1～3:1～2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积35～65％的步骤(3)中制得的50mg/mL N‑乙酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N‑乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.3:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖(UDP‑GlcNAc)反应液；(5)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1～3:1～2的体积比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积40～60％的步骤(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.5:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸‑葡萄糖醛酸(UDP‑GlcA)反应液；(6)将尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖(UDP‑GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸‑葡萄糖醛酸(UDP‑GlcA)反应液按体积比1:0.8～1.2混合，再加入该混合液体积40～100％的步骤(3)制得的50mg/mL透明质酸合酶溶液，充分混匀后，在28～35℃水浴中反应24～48小时，100℃煮沸5～10分钟，得反应液，该反应液命名为透明质酸反应液；(7)将步骤(6)制得的透明质酸反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液；(8)将步骤(7)制得的上清液在30～40℃的条件下旋转蒸发30～60分钟，去除多余的水分，得含透明质酸的浓缩液；(9)选择截留分子量为100～1,000的透析袋，以去离子水作为透析液，对步骤(8)制得的浓缩液实施透析去除小分子杂质，每间隔6‑8小时更换一次透析水，透析3～5次，对透析后溶液冷冻干燥，即获得透明质酸产品。