[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法

摘要

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：提供人类羊膜组织、用PBS缓冲液冲洗然后剪碎、加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化、加入I型胶原酶及高糖DMEM基本培养基至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化、离心分离，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞。与现有技术相比，本发明利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

主权项

一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提供人类羊膜组织；(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；(4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；(5)将羊膜组织剪碎至1mm²后转移至125mL储液瓶中，加入20mL质量浓度为0.5％的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.075～0.2％进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37℃,转速为250～300r/min,消化至组织块融化；(6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物；(7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞；(8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为(3～10)×10⁵/mL置于添加了EGF的培养皿中，移入CO₂培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2～3d换一次培养基；其中，所述无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM培养基；步骤(2)将羊膜组织剪碎至6×6cm²分装于50mL离心管中，步骤(3)胰酶添加量为45mL，并在恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37℃，转速为150～300r/min；步骤(8)采用规格为10cm的培养皿，EGF添加量为100μL，浓度为1μg/mL。