[发明专利]支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种

摘要

本发明公开了一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法包括支原体16s rRNA引物设计；16s rRNA的扩增及回收；阳性质粒及含阳性质粒的菌落的构建和鉴定；转化菌种为大肠杆菌重组菌。本发明涉及一种含有猪源及鸡源支原体保守的16sRNA序列的重组质粒pGM-T-M.hyo，以及含有该质粒的大肠杆菌基因工程菌DH5α/pGM-T-M.hyo，该基因工程菌可用作pGM-T-M.hyo质粒的保存及克隆，通过常规质粒提取法可从该工程菌种获得pGM-T-M.hyo重组质粒；质粒可避免阳性DNA造成的不利影响，且质粒可在大肠杆菌中大量繁殖，因此可采用不同培养法获得大量的阳性DNA，另外质粒DNA较稳定，不易被环境中存在的核酸酶降解。

主权项

一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法，其特征在于，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法包括以下步骤：步骤一，支原体16s rRNA引物设计：根据支原体16s rRNA的保守序列区设计一对引物，用于支原体16s rRNA保守序列区的扩增，引物序列如下：上游引物5’‑GGGAGCAAACAGGATTAGATACCC‑3’；下游引物5’‑TGCACCATCTGTCACTCTGTTAAC‑3’；步骤二，16s rRNA的扩增及回收：以支原体DNA为模板，用16s rRNA保守序列区引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃预变性30s，53℃退火30s，共进行30个循环，最后于72℃延伸10min，结束反应后冷却至4℃；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，并用Takara胶回收试剂盒进行PCR产物的回收；步骤三，阳性质粒及含阳性质粒的菌落的构建和鉴定：纯化后的PCR产物与pGM‑T载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞后，进行阳性克隆菌落的筛选，挑取白斑进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落培养12‑16h后，采用质粒提取方法进行质粒的提取，并将鉴定为阳性的质粒进行测序；经测序为阳性的质粒命名为pGM‑T‑M.hyo。