[发明专利]一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法

摘要

本发明公开了一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法，其步骤是：1、一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法：(1)云斑尖塘鳢精子的采集；(2)精子活力检测；(3)精子的稀释；(4)精液的冻前平衡；(5)加抗冻剂及分装；(6)程序降温；(7)进入液氮。2、一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的复苏方法：(1)从液氮罐中取出冻精；(2)解冻；(3)冻精存放与备用；(4)人工授精。本发明的方法对云斑尖塘鳢精子进行超低温保存及复苏，从而为进一步开展云斑尖塘鳢的杂交育种、人工繁殖以及种质保存提供优质精液，为云斑尖塘鳢遗传改良奠定基础。本发明的方法操作简单，快捷，费用低廉，实用性强。

主权项

一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法，其步骤是：(1)云斑尖塘鳢精子的采集：选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水；用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，用干燥的滴管吸取精液，开头3‑5滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀；(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存；将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用；(3)精子的稀释：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢精液，加入精液3倍体积的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到1∶3；精液与稀释液混匀，备用；(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15～45分钟；(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的云斑尖塘鳢精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，使抗冻剂在精液中的终浓度达到10％；抗冻剂加入后，立即混匀，分装至麦管；所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里；(6)程序降温：将分装好的精液以快速放入程序降温仪的冷冻室中；云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至‑15℃，在‑15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从‑15℃降至‑85℃，最后在‑85℃处平衡10分钟；(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管取出，立即放入液氮罐中，在‑196℃温度中保存。