[发明专利]一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法

摘要

本发明公开了一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，属于生物技术领域。本发明设计的MIT引物由测序接头序列、8‑12个碱基的barcode序列和常规PCR引物组成；本发明中利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法包括：单个体裂解法提取DNA、线粒体DNA(MIT)引物PCR扩增、PCR扩增产物纯化及定量、高通量测序和序列分析，本方法采用特殊的MIT引物，避免了测序文库的构建，通过高通量测序可一次性的获得大量的条形码序列，操作方便，快速，经济，便于推广应用，能高效的构建各种动物条形码数据库。

主权项

1.一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其步骤为：(a)提取DNA：用单个体裂解法提取浮游动物DNA，得到单只浮游动物DNA提取液，采用的裂解液含有25mM的氢氧化钠、0.20mM的乙二胺四乙酸二钠盐、1％的SDS和0.05mg/mL的蛋白酶K的水溶液，pH值为8.0‑8.5；(b)合成MIT引物并进行PCR扩增：以步骤(a)中得到的单只浮游动物DNA提取液为模板，MIT引物进行PCR扩增，所述的MIT上游引物是由测序接头序列、barcode序列以及普通CO1上游引物依次连接组成，所述的MIT下游引物是由普通CO1下游引物及测序接头序列依次连接组成，或者由普通CO1下游引物、barcode序列及测序接头序列依次连接组成，所述的barcode序列长度为8‑12bp，序列中GC碱基的含量为40‑60％；(c)PCR扩增产物纯化及定量：用割胶回收试剂盒或者PCR纯化试剂盒对步骤(b)中得到的PCR产物进行回收或纯化，用DNA定量试剂盒对DNA进行定量，纯化、定量后的PCR产物用DNA分析仪进行片段大小分析；(d)高通量测序：用高通量测序仪对步骤(c)中纯化后的PCR产物进行高通量测序，测序结果以fastq格式输出，过滤测序质量值低和长度短的序列，根据MIT引物中的barcode序列将测序结果分为不同的样本组；(e)序列分析：根据步骤(d)中得到的不同样本组中的序列分别进行多重序列比对，根据多重序列比对结果，依据遗传距离进行序列分组，选取每组中最长的序列作为本组的代表序列并进行BLAST注释；(f)确定条形码序列：参考物种的分类鉴定信息，选取样品所测序列的注释信息和分类鉴定信息最接近的序列组作为本样品的条形码序列。