[发明专利]FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种FMDV（口蹄疫病毒）通用型和O型二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法。该方法包括引物设计、总RNA的制备、反转录、FMDV通用型和O型标准品的制备、二重FQ-PCR反应、结果判定等步骤。本发明所提供的FMDV-T/FMDV-O二重TaqManMGBFQ-PCR检测方法可实现一个反应同时对通用型和O型FMDV进行快速鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测FMDV的要求。

主权项

一种FDMV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）引物设计引物序列包括一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT‑F P1、FMDVT‑R P2 、FMDVO‑F P3、FMDVO‑R P4，两条TaqMan MGB探针FMDVT‑MGB‑FAM‑Probe Probe‑P5、FMDVO‑MGB‑VIC‑Probe Probe‑P6，具体序列如下：P0：cgggaaacgcatgagcagta，P1：cggcctctcatccaacaga，P2：attttccttcaggcgcttga，P3：gcgcgctcctccgtact，P4：cgtgtttcactgccacttctaga，Probe‑P5：5'‑FAM‑ tcatttgtgaaacgcg ‑MGB‑3' ，Probe‑ P6：5'‑ VIC‑ ccacctactacttcgca ‑MGB ‑3'；（2）总RNA的制备以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK‑21细胞培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；（3）反转录将步骤（2）中所提取的总RNA分别进行反转录；（4）FMDV通用型和O型标准品的制备将含有FMDV‑T基因片段和FMDV‑O基因片段的阳性扩增产物分别连接入pGEM‑T Easy载体，培养、鉴定，将测序正确的pGEM‑T/ FMDV‑T 和pGEM‑T/ FMDV‑O重组质粒，测定并确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；（5）口蹄疫病毒通用型和O型二重FQ‑PCR反应条件  将步骤（4）所得的pGEM‑T/ FMDV‑T 和pGEM‑T/ FMDV‑O重组质粒分别稀释作为检测模板，对照组和待检测样品分别进行荧光定量PCR反应；（6）结果判定阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准；在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞40.0或无；阳性对照的Ct值应≤35.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；检测结果成立的前提下，若样品在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式Ct值≤35.0，而且出现两条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒并且为O型；若样品在“FAM/NONE”或“VIC/NONE”标记模式下出现Ct值≤35.0，而且出现一条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒，但不是O型；Ct值＞38.0或无，并且无特定的扩增曲线，并且阳性对照的Ct值≤35.0，则判定为阴性；38.0≥Ct值＞35.0且有特定的扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。