[发明专利]FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

摘要

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重TaqManMGB荧光定量RT-PCR检测方法。该方法包括引物设计、总RNA制备、反转录、通用型和Asia 1型标准品的制备、二重FQ-PCR反应、结果判定等步骤。本发明所提供的检测方法可实现一个反应同时对两种病毒进行快速鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有时间短、反应迅速、特异性强、敏感度高、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别分型检测口蹄疫病毒的要求，因而在口蹄疫病毒检测鉴别技术领域具有较好的应用价值。

主权项

一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）引物设计引物包括共用的反转录引物P0，口蹄疫病毒通用型的特异性引物对P1/P2及荧光探针Probe‑P5，口蹄疫病毒Asia 1型特异性引物对P3/P4及荧光探针Probe‑P6，引物序列如下所示：引物P0：5'‑cgggaaacgcatgagcagta‑3'，引物P1：5'‑cggcctctcatccaacaga ‑3'，引物P2：5'‑attttccttcaggcgcttga ‑3'，引物P3：5'‑aagagcacccaaacccttga‑3'，引物P4：5'‑gccccgaccagtgtgtgt‑3'，探针Probe‑P5：5'‑FAM‑tcatttgtgaaacgcg ‑MGB‑3' ，探针Probe‑ P6：5'‑NED‑ ctcatgcagatcccct ‑MGB ‑3'；（2）总RNA制备以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK‑21细胞培养物为阴性对照，与含有口蹄疫病毒的待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；（3）反转录对步骤（2）中提取的总RNA进行反转录，反转录产物－20℃冻存备用；（4）通用型和Asia 1型标准品的制备将口蹄疫Asia 1型灭活疫苗用常规RT‑PCR方法分别扩增通用型和Asia 1型，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM‑T Easy载体中；确定测序正确的通用型和Asia 1型重组阳性质粒的浓度和纯度，－20℃保存备用； （5）通用型和Asia 1型二重FQ‑PCR反应 以步骤（4）所得的pGEM‑T‑通用型和pGEM‑T‑Asia 1型阳性重组质粒作为检测模板，进行二重FQ‑PCR；（6）结果判定在“FAM/NONE”和“NED/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照的Ct值应≤32.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤32.0，而且出现两条特定的扩增曲线，判定为阳性，表明样品中存在口蹄疫Asia 1型病毒；Ct值＞35.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中无口蹄疫病毒；35.0≥Ct值＞32.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；对可疑样品重新试验，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；在检测结果成立的前提下，若在“FAM/NONE” 标记模式下样品Ct值≤32.0，而且出现特定的扩增曲线，在“NED/NONE” 标记模式下样品Ct值＞35.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为通用阳性，表明样品中存在口蹄疫病毒，但非Asia 1型病毒。