[发明专利]一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法

摘要

本发明涉及一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，首先应确定欲修饰的基因数目N，然后将各个基因的CDS区分别引入pOE‑1至pOE‑N中，同时也可以将每个基因对应的shRNA序列分别引入pSH‑1至pSH‑N中。通过将pOE‑1至pOE‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因串联过表达的最终质粒；或者将pSH‑1至pSH‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因同时knock‑down的最终质粒；同样的，也可以选择其中几个基因的过表达质粒和另外基因的knock‑down质粒和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出既含有多个基因过表达，同时将另一些基因knock‑down的最终载体。与现有技术相比，本发明的构建过程一步式，过程简便，效率高，同时可对多个目的基因进行任意组合。

主权项

1.一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建过表达质粒：1.1)确定欲过表达的基因个数为N；1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE‑1、pOE‑2直到pOE‑N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；1.5)分别提取N个质粒；2)构建敲低质粒：2.1)确定欲敲低的基因个数为N；2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH‑1、pSH‑2直到pSH‑N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；2.3)挑选3个克隆子，并测序验证；3)构建过表达和敲低混合质粒：3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中；3.2)通过测序和菌落PCR验证序列的正确性，并将BsaI位点进行突变；4)按体积比，在离心管中顺序加入如下样品：5)将步骤4)混合体系混匀后置于PCR仪中，进行加热反应；6)反应结束后，取出反应物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反应产物、ATP与PlasmidSafe DNase体积比为16:2:2；7)步骤6)所得体系在37℃条件下孵育，然后将反应产物转化入感受态细胞中，并涂布于含有IPTG和X‑gal的kana平板上，37℃孵育过夜；8)第二天，挑取3个蓝色菌落进行扩增；9)第三天，提取质粒并鉴定；所述的N为大于1的正整数，pOE质粒均包含有一个CMV启动子、一个多克隆位点、一个bGH polyA序列、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，并且两个BsaI位点分别位于CMV启动子上游和bGH polyA序列下游；pOE‑1～pOE‑10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，其中质粒pOE‑1～pOE‑10用于基因的过表达；pSH质粒均包含有一个U6启动子、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于U6启动子上游和下游；pSH‑1～pSH‑10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pSH‑1～pSH‑10用于基因的敲低；pBL质粒均包含有一段100bp的非编码stuffer序列、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于非编码stuffer序列的上游和下游；pBL‑1～pBL‑10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pBL‑1～pBL‑10用于填补位置空缺；pDV质粒均包含有一个CMV启动子、一个EGFP编码序列、一个SV40polyA序列、一个SV40启动子、一个NeoR/KanaR序列、一个ori复制区和一个lacZ基因，两个BsaI位点分别位于lacZ基因的上游和下游；pDV‑1～pDV‑10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pDV‑1～pDV‑10为最终目的载体。