[发明专利]一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用

摘要

本发明提供一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用，所述RNA标准物质由如下步骤制得：先获得用于CTLA-4核酸检测的C基因序列，再获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体，即PET32a-CP载体；然后获取CTLA-4 C-基因和CP基因的原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4；将原核表达载体转入原核表达菌株中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；接着进行DNaseⅠ消化、纯化后，稀释得装甲CTLA-4基因的RNA标准物质。本发明物质具有稳定性，无生物传染性，耐核糖核酸酶等特性，在免疫抑制因子CTLA-4核酸检测中作为标准物质。

主权项

一种装甲CTLA‑4基因的RNA标准物质，其特征在于：所述装甲CTLA‑4基因的RNA标准物质由如下步骤制得：步骤10、获得用于CTLA‑4核酸检测的C基因序列片段，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述C基因为CTLA‑4基因中的一个片段；步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体，具体过程如下：根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：MCP1:5'‑ CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC‑3' ； MCP2: 5'‑CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT‑3' ；预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a‑CP载体；所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；步骤30、CTLA‑4 C基因和CP基因的表达载体的获取，具体如下：携带C基因的T载体，在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收140bp小片段；同时进行PET32a‑CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将CDS基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a‑CP‑CTLA‑4；步骤40、原核表达载体PET32a‑CP‑CTLA‑4转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；步骤50、将步骤40获得的表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清；加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有CTLA‑4基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有CTLA‑4 C基因RNA假病毒颗粒产物；步骤60、将含有CTLA‑4 C基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含CTLA‑4基因RNA标准物质，即装甲CTLA‑4基因的RNA标准物质。