[发明专利]一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用在审
申请号: | 201410811975.2 | 申请日: | 2014-12-24 |
公开(公告)号: | CN104560973A | 公开(公告)日: | 2015-04-29 |
发明(设计)人: | 刁卫平;王述彬;刘金兵;潘宝贵;戈伟;郭广君;高长洲 | 申请(专利权)人: | 江苏省农业科学院 |
主分类号: | C12N15/11 | 分类号: | C12N15/11;C12Q1/68 |
代理公司: | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人: | 李纪昌 |
地址: | 210014 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用,该方法是一种利用辣椒疫病转录组和全基因组测序数据信息、差异表达基因鉴定、生物信息学分析、分子标记开发以及疫霉菌接种鉴定来获得辣椒疫病抗病候选基因,属于辣椒生物技术领域。该方法包括辣椒高抗、高感疫病材料构建的F2群体接种疫霉菌后获得的疫病抗、感基因池转录组测序、差异基因表达分析和功能注释、辣椒疫病高抗、高感材料基因组DNA提取、引物设计和PCR扩增、序列差异分析和SNP位点鉴定、SNP特异引物设计及有效性验证等步骤,高效的获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。该发明可以精准地鉴定出辣椒疫病抗性候选基因及开发有效的分子标记。 | ||
搜索关键词: | 一种 获得 辣椒 疫病 抗性 候选 基因 分子 标记 方法 应用 | ||
【主权项】:
一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法,该方法包括:1)辣椒转录组测序:利用辣椒高抗和高感疫病材料杂交获得F1,F1自交获得F2,对F2群体进行辣椒疫霉菌接种,分别采集F2群体接种0天和5天后的样品备用;接种辣椒疫霉菌10天后,调查F2群体发病情况,分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池,命名为KC0(抗池对照)、KC5(接种5天后的抗池)、GC0(感池对照)和GC5(接种5天后的感池),利用测序仪器对抗、感池分别进行转录组测序;2)差异基因表达分析:利用生物信息学软件对4个辣椒疫病抗、感基因池的测序数据进行合并组装,首先将各样品数据进行低质量过滤,使Q20达到99%以上,再将过滤后各样品数据合并在一起根据相似度进行聚类,在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列,完成Unigene库的构建,利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度,再利用生物信息学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因;3)差异基因功能注释:在NCBI网站上使用Blastn、Blastp和InterProscan软件对筛选到的差异表达基因进行数据库比对,获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预测结果,根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫霉病抗性相关的差异表达基因;然后利用上述差异表达基因片段,在辣椒全基因组数据库(http://peppergenome.snu.ac.kr和http:// peppersequence.genomics.cn)中进行Blastn比对,获得差异表达基因即辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框(ORF);4)SNP位点的鉴定:针对所获得的辣椒疫病抗性相关基因ORF的序列特征,利用生物信息学软件设计特异引物;对辣椒高抗疫病和高感疫病材料进行扩增,扩增产物经琼脂糖电泳后,回收、克隆并测序;利用生物信息学软件DNAman对高抗和高感疫病辣椒材料的扩增产物进行序列比对,找出辣椒疫病抗性相关基因序列在高抗和高感疫病辣椒材料中存在的SNP位点;5)辣椒疫病抗性候选基因的获得:针对辣椒疫病抗性相关基因序列在辣椒高抗和高感疫病材料中所鉴定到的SNP位点特征,利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高抗和高感辣椒疫病材料以及高抗和高感疫病材料杂交、自交获得的F2群体进行扩增,同时对高抗、高感以及F2群体进行辣椒疫霉菌接种,10天后调查发病情况;最后,SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果,筛选到只在高抗材料中扩增出条带,而在感病材料中无扩增条带的引物,此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。
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