[发明专利]当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法

摘要

本发明公开了一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法，其制备方法为：将灭菌后贮藏根切片，置于筛选培养基上处理后促使根切片中非形成层细胞的部分死亡或损伤或停止生长；再将切片放入分离培养基中培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，初步分离得形成层细胞；将其移至继代培养基中培养后，再移至分离培养基中重复交替地培养，直到获得一种稳定的含有大量小液泡的细胞。本发明提供的形成层干细胞培养方法有悬浮培养和发酵罐培养的方法。本发明实现了对当归属形成层干细胞的分离，并对其扩大培养提供了新的方法，对当归属植物贮藏根形成层干细胞大量的工业生产奠定了基础，也为当归属植物贮藏根形成层干细胞提供了新的细胞来源。

主权项

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处理，使外植体的表面和内部均无菌体存在；2）外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片；3）筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4℃~30℃条件下处理16~72h，使切片中非形成层部分的细胞不发生分裂；所述筛选培养基为含有蔗糖1～6%和琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为2～12；4）分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞；所述分离培养基为含有生长素0.1～2mg/L、蔗糖1～6%、琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9；所述生长素选自二氯苯氧乙酸（2，4‑D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IBA）中至少一种；5）继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞； 所述继代培养基为含蔗糖1～6%、0.2~1.2mg/L 2,4‑D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA、7.5~8.5g/L琼脂、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0～5.9。