[发明专利]嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建

摘要

本发明提供了一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养；步骤B：基因组DNA的提取与融合蛋白基因序列构建；步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应(PCR)法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因；步骤D：构建重组表达载体；步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中。发明的嗜热β-1，4木聚糖酶具有极高的热稳定性，耐碱性环境以及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用于生物质能源生产、功能糖、功能糖醇生产中。

主权项

一种嗜热β‑1，4木聚糖酶‑His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的嗜热β‑1，4木聚糖酶‑His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养；步骤B：基因组DNA的提取将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β‑1，4木聚糖酶‑His融合蛋白目的基因通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在聚合酶链式反应过程中同步获得融合蛋白xyl‑his，其中，上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；下游引物：5’CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATAGCCCA 3’，划线部分为Xho I的酶切位点；以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在所述上游引物和下游引物的参与下进行聚合酶链式反应，得到聚合酶链式反应扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物，然后用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，得到嗜热β‑1，4木聚糖酶‑His融合蛋白目的基因；将其与同样进行双酶切的pET‑28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接，采用点击的方式转化入大肠杆菌DH5α中，筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定，成功获得含有融合蛋白的质粒pET‑28a(+)‑xyl‑His；步骤D：构建重组表达载体将pET‑28a(+)‑xyl‑His和pRSII418采用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，将获得的xyl‑His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接，得到重组表达载体pRSII418‑xyl‑His；步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养，采用腺嘌呤缺陷型培养基进行筛选，并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证，最终获得了具有嗜热β‑1，4木聚糖酶‑His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。