[发明专利]从干燥杏叶片中提取DNA的方法

摘要

本发明属于植物DNA制备技术领域，涉及一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法。首先进行叶片中次生代谢物质的抽提，用预冷缓冲浸提液对碾磨好的干杏叶冰浴、离心、弃上清，反复浸提数次，可将杏叶中多糖、多酚、酯类等次生代谢物在DNA释放前将其除去，防止与DNA形成复合体；在液氮碾磨和缓冲浸提液处理时，加入适量PVP-40T，保护DNA免受氧化,促进了细胞裂解,使其释放更多的DNA；加入适量RNA酶的操作置于细胞裂解后，除去了RNA，同时将引入的蛋白酶除去；采用改良CTAB法，用适量苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，除去大量蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。与常用方法相比，本发明成本低廉。

主权项

一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法，其特征在于下列步骤：(1)去除杏叶的叶柄，称取20mg叶片，加入0.001克的PVP‑40T，加入液氮，将叶片研磨成细粉末状，将细粉末加到2.0mL的离心管中；(2)加入1mL预冷的缓冲浸提液，混匀后冰浴15分钟，冰浴过程中颠倒混匀2‑3次；(3)在7000g下离心10min，弃上清；(4)重复步骤(2)和(3)，直至上清不黏稠；(5)每管迅速加入0.8mL预热至沸腾的CTAB Buffer，混匀，65℃水浴0.5‑1h，间隔15min摇匀一次；(6)加入0.01mL 100mg/L RNase，37℃水浴30–60min；(7)取出后冷却至室温，每管加入0.8mL的体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，4℃保存，轻轻颠倒充分混匀15分钟，室温下10000g离心10min；(8)吸上清并置于新的2.0mL离心管中，加入0.7mL的氯仿：异戊醇按体积比为24：1的氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀15分钟，10000g离心10min，置于另一1.5mL离心管中；(9)加入0.5mL‑20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后‑20℃垂直放置30min；(10)在10000g离心10min，弃上清，再短暂离心收集剩余液体，用移液枪吸除剩余液体；(11)加入0.5mL 75％浓度的乙醇溶液，轻轻弹起沉淀，在10000×g离心2min，弃上清；(12)重复步骤(11)；(13)风干乙醇，加入0.1mL TE溶解DNA；(14)测定DNA的浓度和纯度，得到DNA样品；相关试剂及配制方法如下：(1)母液配制：1)1000.0mL1.0mol/LTris‑HCl，pH8.0，母液：称量Tris 121.10g，加入500.0mL双蒸水溶解，用1.0mol/L HCl调pH至8.0，定容至1000mL，混匀，灭菌，4℃保存；2)500.0mL 5.0mol/L NaCl母液：146.00g NaCl用双蒸水溶解、定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；3)500.0mL 0.5mol/L EDTA母液：93.05g Na2EDTA·H2O加350.0mL双蒸水溶解，10.0mol/L调pH至8.0，定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；4)250.0mL 3.0mol/L NaAc，pH5.2‑5.3，母液的制备：取102.00g NaAc·3H2O，用少量双蒸水溶解，用3.0mol/L乙酸调pH至5.2，定容至250.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；(2)相关试剂的配制：1)100.0mL，2％浓度的CTAB Buffer的配制方法：称取CTAB 2.00g，偏重亚硫酸钠0.10g，PVP 1.00g，加入1.0mol/L Tris‑HCl 10.0mL，5.0mol/L NaCl 30.0mL，0.5mol/L EDTA 10.0mL，混匀后加双蒸水至100.0mL，煮沸，提取前趁热迅速加2mLβ‑巯基乙醇，混匀；2)TE缓冲液，pH8.0，10.0mmol/L Tris‑HCl，1.0mmol/L EDTA；3)pH8.0的100mL TE缓冲液配制方法：1mL 1mol/L的Tris‑HCl和200μL 0.5mol/LEDTA混匀后定容至100.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；(3)缓冲液配制：1.缓冲浸提液配方，100mL