[发明专利]抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法

摘要

本发明提供了一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法，其步骤包括：1)A431细胞复苏、传代；2)准备96孔板单层A431细胞；3)样品和rhEGF的稀释；4)将样品的7个稀释梯度加入到铺有A431细胞的96孔板，加入rhEGF；培养；5)加入甲醛固定；TBS洗板2次；加入TritonX-100，孵育；TBS洗板1次；加入H2O2，孵育；TBS洗板1次；加入locking buffer，孵育；6)加入一抗稀释液；孵育过夜；弃去一抗稀释液，TBST洗板4次；加入二抗稀释液，避光孵育；弃去二抗稀释液，TBST洗板3次；7)加入TMB，避光孵育；加入H2SO4，终止显色；8)A450nm和A650nm下读数。本发明的方法能够有效、精确地检测抗EGFR单克隆抗体的生物学活性。

主权项

一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法，其步骤如下：1)A431细胞复苏、传代；2)准备96孔板单层A431细胞；3)样品和rhEGF的稀释：样品先稀释到0.12mg/ml，再以2倍梯度稀释7个浓度梯度，稀释rhEGF到100ng/ml；4)将样品的7个稀释梯度加入到铺有A431细胞的96孔板，每孔50μl；按每孔50μl体积加入浓度为100ng/ml的rhEGF；细胞经以上处理后，放入37℃、5％CO2培养60分钟；5)弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μl 4％甲醛固定15min；每孔100μl TBS洗板2次；每孔加入100μl 0.1％TritonX‑100，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 1％H2O2，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 2×Blocking buffer，孵育60min；6)弃去2×Blocking buffer，每孔加入100μl一抗稀释液；96孔板放入2‑8℃孵育过夜；弃去一抗稀释液，每孔100μl TBST洗板4次；每孔加入100μl二抗稀释液，避光孵育60min；弃去二抗稀释液，每孔200μl TBST洗板3次；7)每孔加入100μl TMB显色底物，避光孵育10‑25min，或孵育至显蓝色到预期深浅；每孔加入100μl 2mol/L H2SO4，终止显色；8)96孔板放入读板机，检测A450nm和A650nm下读数。