[发明专利]一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法

摘要

本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。本发明的方法具有更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用的优点。

主权项

1.一种在体外利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)‑hCas9‑NLS，具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)‑hCas9‑NLS；(2)、构建gRNA表达载体pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA，具体过程为：(a)、合成SEQ ID No.1所示gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5μL，再加入1μL 10×LA PCR Buffer，混匀，95℃加热10min，然后置于室温1h，形成带有两个粘性末端的DNA双链；(b)、pSicoR‑GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤(1)所得DNA双链克隆到pSicoR‑GFP中，得到pSicoR‑GFP‑gRNA；(c)、以pSicoR‑GFP‑gRNA为模板，以SEQ ID No.8所示的T7‑gRNA_F、SEQ ID No.9所示的T7‑gRNA_R为引物进行PCR反应；将PCR产物，克隆至pMD18‑T载体，得到pMD18‑T‑T7‑gRNA；将pMD18‑T‑T7‑gRNA和pSicoR‑GFP载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，回收120bp和7.5kb的DNA条带，然后将回收的两段DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取质粒pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA；(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA中；所述目的基因靶序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA；(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1(+)‑hCas9‑NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎细胞的胞质中，实现敲除；其中获得gRNA2#的sgRNA的具体过程为：(ⅰ)、将SEQ ID No. 27和SEQ ID No. 28所示的带有BsmBI粘性末端的2#靶点序列退火组装成DNA双链；(ⅱ)、再将pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA载体用BsmBI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于‑20℃，备用；(ⅲ)、将步骤(ⅰ)和(ⅱ)的产物进行连接，将克隆的到的载体命名为pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA2#；(ⅳ)、用限制性内切酶DraIII和PsiI将pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA2#质粒线性化；其中，酶切反应体系为pSicoR‑GFP‑T7‑gRNA2# 质粒10 μg，NEB 的 限制性内切酶PsiI 5 μL，10×CutSmart Buffer 10 μL，加超纯水至100 μL，酶切反应条件为37℃反应6h；(ⅴ)、将线性化的质粒经过乙醇沉淀后，用于体外转录；乙醇沉淀步骤：在酶切产物中，加入0.1倍体积的3M，PH=5.2的醋酸钠，混匀；再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于‑20℃ 30 min；12,000×g离心10 min，去除上清，加入1ml 70%乙醇，12,000 g离心2 min，去除上清，置于超净工作台风干，加超纯水溶解4h以上，备用。