[发明专利]ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法

摘要

本发明涉及生物领域，特别涉及ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法。本发明不需用到任何同位素标记的材料因此克服了现有技术不利于安全操作的缺陷；分离的细胞不需要长时间培养来检测克服了现有技术检测周期长的缺点；细胞只需裂解就可快速检测，克服了现有技术操作繁琐的不足，且受实验条件影响小。本发明还提供了非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，操作方便快捷安全，敏感性好，精确度高，可检测范围宽，结果可较准确获得机体的免疫状态。

主权项

一种非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，其特征在于，分离PBMC细胞， 测定基础ATP，包括如下步骤：（1）用肝素抗凝管采集血液，分离前上下颠倒混匀8次，使细胞分布均匀；（2）取一支15ml离心管，加入5ml无FBS的 RPMI1640，用巴氏吸管加入RPMI1640和血液体积比为1:1的血样，轻轻地上下颠倒混匀8次，达到颜色均一；（3）另取一支新的15ml离心管，用电动移液枪加入5ml Ficoll分离液，使分离液与血样体积比为1:2，将离心管倾斜一定角度，用巴氏吸管小心将稀释的血样加到Ficoll上层，使分层清晰；（4）将离心机条件设置为800g，20℃，acce，Brake均设为0，离心30min；（5）离心后用巴氏吸管弃掉血浆至白色分层上约0.5‑1cm处即可，切勿搅动白膜层；（6）再用巴氏吸管小心转移白膜层至一支新的1.5ml离心管，吸出体积为1.5ml；（7）将离心机条件设置为5000rpm， 20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入无FBS的 RPMI至总体积为1.5ml，轻轻吹打重悬细胞；（8）将离心机条件设置为3000rpm， 20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，然后加入1.5ml无FBS的 RPMI，轻轻吹打重悬细胞；（9）第三次将离心机条件设置为400g，20℃，离心10min，离心后倒净离心管中液体并置于吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入1ml无FBS的 RPMI培养基轻轻吹打重悬细胞；取10ul用于台盼蓝染色，计数并计算存活率；（10）取按上述方法分离计数的PBMC细胞每孔30万个，加入到1.5ml离心管中，800g， 20℃，离心7min，离心后倒净离心管中液体后置于吸水纸上吸一下，加入200ul裂解液，在冰上充分裂解细胞5min，然后置于100度水浴锅中煮沸1min，立即置于冰上待测；其中，裂解液由20 mmol/L Tris和2 mmol/L EDTA组成，pH为7.75；（11）在冰上进行标准品配制：冰上溶解10umol/L ATP标准品贮存液，把ATP标准溶液用ATP裂解液稀释成 0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0 umol/L浓度梯度；ATP标准溶液浓度可根据样品中ATP的浓度而调节；（12）在冰上加入10ul样品或标准品于96孔白色不透明酶标板中，置于酶标仪中选择LU，终点法，562nm检测其本底的荧光值；（13）加100ulATP检测液到含样品或标准品的96孔白色不透明酶标板中，迅速用排枪混匀，立即用酶标仪选择LU，终点法，562nm测定；（14）根据ATP含量进行分析：ATP的浓度＜150ng/ml或ATP的浓度≥500ng/ml为免疫能力异常；其中，ATP的浓度＜150ng/ml为免疫力低下；ATP的浓度≥500ng/ml为免疫力超常；150ng/ml≤ATP的浓度＜500ng/ml为免疫力正常。