[发明专利]一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，属于病毒分子检测领域。该方法通过染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F₂和ASPV-cp-R₂为引物进行PCR扩增，获得阳性重组质粒标准品，以阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、采用特异性引物和探针进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；将供试材料按照相同条件进行实时荧光定量PCR，通过比对Ct值与标准曲线，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测。该方法实现了苹果茎痘病毒的定量测定，而且检测结果可直接通过电脑软件读出，避免了检测结果假阳性以及环境污染问题。

主权项

一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、以染毒材料的cDNA为模板，以ASPV‑cp‑F₂和ASPV‑cp‑R₂为引物进行PCR扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；2)、以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV‑Probe3‑F和ASPV‑Probe3‑R为引物、以ASPV‑Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；3)、以供试材料的cDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测；其中，所述ASPV‑cp‑F₂、ASPV‑cp‑R₂、ASPV‑Probe3‑F、ASPV‑Probe3‑R和ASPV‑Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。