[发明专利]一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法。其检测的原理为将核酸适体5′末端标记上荧光基团，设计了一段与核酸适配体互补杂交的序列并在3′末端标记猝灭基团，核酸适体与互补序列杂交时荧光信号很弱，水胺硫磷、丙溴磷识别结合核酸适体时会引起互补序列解离而荧光信号增强，利用荧光信号的变化来建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围，根据标准曲线判断样品中靶标分子的含量。该方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，适用于样品中水胺硫磷和丙溴磷的快速检测。

主权项

一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，基于核酸适体结构转换信号，其特征是包括如下步骤：1)、将核酸适体F‑ssDNA与互补序列Q‑B杂交；核酸适体F‑ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：5′‑FAM‑AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT‑3′；互补序列Q‑B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：5′‑GAATCGCTGCAGCAA‑DABCYL‑3′；互补序列Q‑B与核酸适体F‑ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：核酸适体F‑ssDNA、互补序列Q‑B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(A buffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)；核酸适体F‑ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q‑B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F‑ssDNA与互补序列Q‑B的摩尔比为1：2，体积比为1：1；核酸适体F‑ssDNA与互补序列Q‑B的杂交条件为避光的室温下杂交20min；2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷；对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1，杂交后体系与标准品、样品组反应时间为60min；样品组的前处理步骤为：取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，取1g放入试管中，加入5mL丙酮，室温下超声波振荡提取10min，过滤，在沸水浴上将丙酮挥发干，用1mL含有1％丙酮的A buffer振荡溶解提取物，过0.45μm滤膜后待测；3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化；取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm；4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；对水胺硫磷的检测线性范围为50‑500μmol/L，线性回归方程为y＝227.20x+33325，线性回归系数为0.9978，检出限为30.224μmol/L；对丙溴磷的检测线性范围为100‑500μmol/L，线性回归方程为y＝195.20x‑18519，线性回归系数为0.9975，检出限为86.874μmol/L。