[发明专利]折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法。所述试剂盒由含镁模板缓冲液及无镁单一组合试剂组成，包含了板DNA制备和折叠引物PCR反应全套试剂。所述折叠引物以疟原虫Cyt b基因作为靶基因，在疟原虫属、种特异位点进行设计，显著提高了折叠引物PCR检出4种疟原虫的敏感性和特异性，同时简化试剂和试验操作。采用本发明的试剂盒进行检测，使试剂复杂操作繁重的传统套式/多重PCR简化为单一试剂、单管一步扩增反应，即可同时检出和鉴定4种疟原虫单独或混合感染，检出单种感染的低限均达到或接近1个虫/μl血；在混合感染高、低密度相差100倍时仍能同时检出和准确鉴定4种原虫。是省市各级医院和实验室疟疾确诊和鉴别诊断的可靠手段。

主权项

一种折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒，所述诊断试剂盒由模板缓冲液和PCR单一组合试剂组成；其中所述的模板缓冲液为1×含镁模板缓冲液1.0ml×2支，或1×含镁模板缓冲液1.0ml×1支和0.1×模板缓冲液预装0.5ml管×20支，所述预装管每管400μl；其中所述的单一组合试剂为折叠引物PCR无镁单一组合试剂200μl×1支或预装PCR管折叠引物PCR无镁单一组合试剂每管10μl×20支；其特征在于：所述的1×含镁模板缓冲液包含以下组分：30mmol Tris‑HCl；30mmol KCl；15mmol(NH4)2SO4；6.6mmol MgCl2；所述的无镁单一组合试剂包含以下组分：具有不同退火与折叠温度的折叠引物6条；Tris‑HCl 30mmol/L；KCl 30mmol/L；NH4SO4 15mmol/L；TMAC 0.001mmol/L；4种核苷酸‑4dNTP各200μmol/L；DNA聚合酶‑Taq酶0.5U；石蜡油15μl；所述的具有不同退火与折叠温度的折叠引物，包括疟原虫属特异公共引物一对，编号Uf‑1865、Ur‑2855；恶性疟原虫(PF)种特异正向引物1条，编号Ff‑2545；间日疟原虫(PV)、三日疟原虫(PM)、卵形疟原虫(PO)种特异反向引物各1条，编号Vr‑2343、Mr‑2520、Or‑2748；所述引物的设计是在每条引物的5’端添加与3’端互补的核苷酸序列，所述3’端即第2～4碱基起至第8～18碱基，具体序列如下：Uf‑1865 5'GTCAAATGGCGTGGAAACACACTTCCCTTCTCGCCATTTGATAG 3'Ur‑2855 5'CTAAGAAGGTTCGATAACCTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'Ff‑2545 5'GCTTCTGGATATTATGATAGATAACATACCAGAAG 3'Vr‑2343 5'CGGTGATGCTACTTACTTGGAGAATGTTTTGCATCACCT 3'Mr‑2520 5'GGTATAAAGGATTTTAGTTTATCTCCATGTCCTTTATACG 3'Or‑2748 5'CGGAAGGATGTAAAAGCACATTTAATATCTTATCCTTCCA 3'所述的折叠引物中，每条属、种特异引物最佳初始退火温度间至少相差2～3℃；各条引物3’5’端互补退火的折叠温度比引物与模板靶序列的初始退火温度低1～2℃，各扩增片段之间的大小相差150bp以上。