[发明专利]一种体外诱导扩增NK细胞的方法

摘要

本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml~9.76μg /ml，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物Th‑t、水煮脱糖部位Th‑w3、石油醚部位Th‑p或水部位脱糖部位Th‑w2；本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；利用本方法所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。

主权项

一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml；所述三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为取三叶青干燥药材，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得三叶青总提取物；或者，所述三叶青提取物为水煮脱糖部位Th‑w3，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，除去提取液后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克；或者，所述三叶青提取物为石油醚部位Th‑p，取三叶青总提取物，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚进行萃取，得到石油醚部位TH‑p；或者，所述三叶青提取物为Th‑w2，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH‑t 21.6g，取此总提取，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚，进行萃取，得到石油醚部位TH‑p 0.15g，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位TH‑a 0.58g，用正丁醇萃取得到正丁醇部位TH‑b 2g，以及水部位TH‑w，取水部位TH‑w进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次洗脱，其中，30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到水部位脱糖流分TH‑w2。