[发明专利]卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，针对采用多亲本制备混合家系的实例，筛选出11对遗传多样性高、扩增效率稳定的微卫星引物。结合毛细管电泳测序及软件分析，达到检测卵形鲳鲹家系个体亲子关系的目的。通过本发明的方法，卵形鲳鲹亲子鉴定准确率能够达到90％以上。

主权项

一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，该方法包括如下步骤：1)选择卵形鲳鲹体型较大，生长速度较快的个体87尾作为亲本，将亲本混合进行人工繁殖；待鱼苗长到10公分时随机选取1万尾转入网箱养殖，作为用于亲子鉴定的家系群体；2)选取步骤1)的卵形鲳鲹繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用51对微卫星引物进行巢式PCR扩增；3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加M13序列5’‑TGTAAAACGACGGCCAGT‑3’；位点特异性反向引物；FAM、PET、VIC、NED四种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系20μL：50ng DNA，2μL dNTP，2μL 10×Buffer mixture，1U rTaq，0.4μL的含加通用引物M13的正向引物10mM，0.5μL反向引物，0.1μL的荧光标记通用引物，ddH2O补足；4)卵形鲳鲹亲本在51个微卫星位点的PCR产物经ABI3730型基因分析仪，根据荧光标记进行基因型分析，使用Genemapper3.7软件模拟分析，筛选出适合鉴定卵形鲳鲹混养家系的有效微卫星位点11个：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、TBG016；所述11个有效微卫星位点是由以下引物序列5’‑3’扩增获得：ZD13‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTAGCTTTGCATTGTGTG；ZD13‑R：CAGCCCAGTCAGTCCCTACT；ZD15‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACGTGTTCCACAGCAAGAA；ZD15‑R：AGGAATGGTCCCAAAGAATG；TBG008‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCGCGACAAACTTTAACTCATCTC；TBG008‑R：AGCATTTTCACCTCCTCCATTG；ZD02‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTAGGACACCATCCCCTCA；ZD02‑R：GCTCCTGTGGAGGACAGAGA；ZD03‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTATATCAGCGTCCACCCAAAC；ZD03‑R：CTTTTCCATCTCTCCCCTCA；ZD04‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGGAGACCATGACG；ZD04‑R：CTCCTGGAGGAACTGTGGAG；ZD11‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGAGCAGGACGTCCAAAA；ZD11‑R：CTTTTCCATCTCTCCCCTCA；ZD12‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCACCATCAATCAGCTGTCA；ZD12‑R：AGGTGCTCCACAGATGTTCC；ZD01‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTTGAAAAATCAGGCAAG；ZD01‑R：TGCCAGGGAAAAGAGAGAGA；ZD10‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCTGTAGAGAACCAGAACAGTC；ZD10‑R：GCTCCTGTGGAGGACAGAGA；TBG016‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTAGAAATACATCCTGGGTCACT；TBG016‑R：GAACCGGAGTCTGTAAACAAGAT；5)将卵形鲳鲹1万条子代混养7月龄，随机选取2000尾个体，在每条鱼的背部肌肉植入电子标记并剪取每个个体鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的11个有效微卫星位点，分析子代的基因型；6)根据亲本和子代在11个微卫星位点的基因型，采用PAPA 2.0软件对不同子代进行区分，鉴定子代个体的父母本。