[发明专利]一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞

摘要

本发明公开了一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。本发明根据山羊β‑乳球蛋白基因，设计并构建了针对其第一外显子的TALEN真核表达载体以及含有较短同源臂的BLG基因敲除载体，与以TALEN表达载体为模板体外转录的mRNAs共同转染山羊胎儿成纤维细胞，经药物筛选及鉴定后得到β‑乳球蛋白基因敲除细胞。本发明利用TALEN技术大大提高了基因打靶效率，同时较短同源臂的利用可以更方便高效的进行中靶细胞的筛选，mRNAs的利用则避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合。 1

主权项

1.基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述载体为TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体；所述TALEN真核表达载体为上游位点识别表达载体和下游位点识别表达载体；所述的BLG基因敲除载体为含有5’同源臂和3’同源臂的打靶载体，其中5’同源臂的末端和3’同源臂的首端落在TALEN识别位点之间，并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框；所述的TALEN真核表达载体所针对的TALEN识别位点位于BLG基因第一外显子；所述的TALEN真核表达载体所表达的蛋白识别BLG基因第一外显子上的TALEN识别位点，切割并产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复；所述的BLG基因敲除载体的5’同源臂、3’同源臂分别与BLG基因的同源序列发生同源重组，5’同源臂、3’同源臂同时发生同源重组是5’同源臂与3’同源臂之间间隔的BLG阅读框被敲除；所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子靠近信号肽序列的序列；所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子上游1000～1500bp的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子下游1000～1500bp的序列相同源；两者之间间隔10～30bp的BLG阅读框；所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子的+47～+94位序列，其中上游识别位点为+47～+62位，下游识别序列为+78～+94位；所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子的‑1028～+60位的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子的+80～+1422位的序列相同源；所述的上游位点识别表达载体是载体pCS2‑BLG‑L，通过将上游识别位点序列TALEN‑BLG‑L克隆到载体pCS2‑FokI‑PEAS得到；所述的下游位点识别表达载体是载体pCS2‑BLG‑R，通过将下游识别位点序列TALEN‑BLG‑R克隆到载体pCS2‑FokI‑PERR得到；所述的BLG基因敲除载体是将5’同源臂、3’同源臂分别克隆于包含loxP位点的载体ploxPⅡ中，其中5’同源臂位于loxP位点的上游，3’同源臂位于loxP位点的下游；所述的TALEN‑BLG‑L序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的TALEN‑BLG‑R序列如SEQ.ID.NO.2所示；所述的BLG基因敲除载体为载体pBLG‑Neo，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。